非靶向代謝組學(xué)能夠提供微生物代謝的全局視野，但其應(yīng)用長期受兩大相互交織的問題制約：一是難以將真正來源于細(xì)胞活動(dòng)的代謝物信號(hào)，與加合物、源內(nèi)碎片等 MS 衍生信號(hào)及化學(xué)污染物等背景干擾準(zhǔn)確區(qū)分；二是難以在多種營養(yǎng)素同時(shí)存在的競爭條件下，定量解析細(xì)胞對(duì)不同碳源和氮源的利用。傳統(tǒng)同位素示蹤多追蹤單一標(biāo)記底物的去向，難以回答“多種營養(yǎng)并存時(shí)細(xì)胞如何選擇”這一核心生理問題；現(xiàn)有計(jì)算工具多以單峰驗(yàn)證為主，在復(fù)雜質(zhì)譜數(shù)據(jù)中采用固定的質(zhì)量與保留時(shí)間容差，容易產(chǎn)生隨機(jī)匹配和假陽性關(guān)聯(lián)，進(jìn)而干擾對(duì)真實(shí)代謝網(wǎng)絡(luò)的理解。
近日，中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所楊立峰研究員研究組與中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院王琳研究員團(tuán)隊(duì)合作，在 Analytical Chemistry 在線發(fā)表題為“TRACE: An Integrated Isotope-Tracing Framework for Metabolite Validation and Nutrient Fate Mapping”的研究論文。該研究提出了整合穩(wěn)定同位素實(shí)驗(yàn)與計(jì)算分析的 TRACE 框架，通過數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的質(zhì)量與保留時(shí)間誤差校準(zhǔn)、同位素峰網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及營養(yǎng)競爭示蹤，實(shí)現(xiàn)了從生物來源代謝物驗(yàn)證到碳、氮營養(yǎng)流向解析的一體化分析。
TRACE 整體工作流程：由穩(wěn)定同位素標(biāo)記建立高置信代謝物種子，并進(jìn)一步開展峰網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與營養(yǎng)流向分析。
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從“檢測(cè)峰”到“驗(yàn)證生物來源代謝物”
為了給代謝物建立實(shí)驗(yàn)層面的判定依據(jù)，研究團(tuán)隊(duì)以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK 為模型，設(shè)置未標(biāo)記、¹?N 標(biāo)記、¹³C 標(biāo)記和 ¹³C/¹?N 雙標(biāo)記四組樣品，并在相應(yīng)標(biāo)記條件下連續(xù)培養(yǎng)超過 10 代，以盡可能實(shí)現(xiàn)充分、均一的穩(wěn)定同位素標(biāo)記。由這些同位素示蹤底物從頭合成的代謝物會(huì)依據(jù)其碳、氮組成產(chǎn)生可預(yù)測(cè)的質(zhì)量位移，為其生物來源提供直接證據(jù)。TRACE 并不將這些經(jīng)同位素確認(rèn)的峰作為分析終點(diǎn)，而是將其作為高置信“種子”，進(jìn)一步在全數(shù)據(jù)集中構(gòu)建峰—峰(peak-to-peak)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。
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數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的動(dòng)態(tài)容差提升網(wǎng)絡(luò)特異性
隨著檢測(cè)到的 LC-MS features 數(shù)量增加，加之代謝物碳、氮原子數(shù)增加會(huì)帶來更多相近的理論標(biāo)記質(zhì)量差，以及同一代謝物可形成多種 MS 衍生形式，候選峰—峰連接數(shù)量會(huì)快速膨脹。
• 配對(duì)數(shù)隨峰數(shù)二次膨脹：峰越多，兩兩配對(duì)的組合數(shù)按平方增長；
• 高 C/N 數(shù)代謝物：碳、氮原子數(shù)越多，理論上可能出現(xiàn)的近似質(zhì)量差組合越密集，固定 ppm 窗口內(nèi)更容易出現(xiàn)隨機(jī)匹配；
• 多種 MS 衍生形式：同一代謝物可形成加合物、碎片和同位素峰，使候選連接規(guī)模進(jìn)一步擴(kuò)大。
在研究中的一個(gè)正離子模式數(shù)據(jù)集中，共檢測(cè)到 24,530 個(gè) LC-MS features。這些峰兩兩組合后，可形成超過 3 億個(gè)潛在連接。上述因素共同決定了：隨著數(shù)據(jù)復(fù)雜度上升，預(yù)先設(shè)置固定的 m/z 與保留時(shí)間容差更容易引入隨機(jī)匹配，這正是 TRACE 引入動(dòng)態(tài)過濾策略的重要原因。
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TRACE 的思路不是直接依賴預(yù)設(shè)的固定誤差，而是利用與理論標(biāo)記模式高度一致的候選 ¹³C/¹?N 峰束，讓數(shù)據(jù)本身刻畫當(dāng)前實(shí)驗(yàn)的實(shí)際誤差范圍。研究發(fā)現(xiàn)，高相關(guān)候選峰束(Pearson ρ > 0.75)的 m/z 誤差和 RT 偏移集中分布在接近零的位置，而背景關(guān)聯(lián)則更加分散。TRACE 據(jù)此對(duì)真實(shí)連接與背景連接的誤差分布進(jìn)行建模，并以擬合信號(hào)成分中央 99% 的范圍定義動(dòng)態(tài) m/z 和 RT 容差。需要強(qiáng)調(diào)的是，高相關(guān)性本身并不足以確定真實(shí)連接；候選關(guān)系還需同時(shí)滿足數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的誤差邊界，才能被保留為高置信連接。經(jīng)過動(dòng)態(tài)過濾后，保留下來的關(guān)系更集中于常見的加合、碎裂和天然同位素形式，同時(shí)減少了生物學(xué)上不合理的元素同位素偏移和低概率碎裂事件。
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從“同位素種子”擴(kuò)展到 MS 衍生形式
高置信 CN 種子建立之后，TRACE 進(jìn)一步將網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)展至與其相關(guān)的 MS 衍生形式，包括同位素對(duì)、碎片對(duì)和加合物對(duì)，并依據(jù)相應(yīng)的 C/N 組成與化學(xué)式變化規(guī)則對(duì)這些關(guān)系進(jìn)行約束。
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TRACE 并不只依賴一對(duì)峰之間的質(zhì)量差，還會(huì)檢查整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的元素組成和化學(xué)轉(zhuǎn)換是否一致。如果某條連接雖然在質(zhì)量差上滿足局部匹配條件，但放入全局網(wǎng)絡(luò)后無法形成合理、連續(xù)的化學(xué)轉(zhuǎn)換路徑，就會(huì)被排除。最終，來自同一化學(xué)實(shí)體的母離子、加合物、碎片和同位素峰可被歸并為一個(gè)代謝物特征組，從而減少非靶向代謝組中的冗余特征并提高注釋一致性。
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多代高分辨質(zhì)譜平臺(tái)拓展代謝組檢測(cè)空間
除 TRACE 算法本身外，研究還利用同一份穩(wěn)定同位素標(biāo)記的酵母提取物開展了跨平臺(tái)比較，Q Exactive Plus、Orbitrap Exploris 480、Orbitrap Astral 、Orbitrap Ascend Tribrid和 Orbitrap Excedion Pro。研究中，除Q Exactive Plus分辨率設(shè)置為14萬外，其他平臺(tái)均設(shè)置為12萬。同時(shí)考察了 Orbitrap Exploris 480 的不同分辨率設(shè)置，以及 Excedion Pro 上 120K non-eDR、120K eDR 和 240K eDR 等采集條件。
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在該研究使用的穩(wěn)定同位素標(biāo)記酵母樣品和相應(yīng)采集設(shè)置下，從 Q Exactive Plus 到 Orbitrap Excedion Pro，總檢測(cè) LC-MS features 數(shù)量增加 331%；與此同時(shí)，經(jīng)穩(wěn)定同位素確認(rèn)的生物來源代謝物絕對(duì)數(shù)量增加 117%。在 Excedion Pro 上，采用 eDR 和更高分辨率后，可檢測(cè)的 LC-MS features 數(shù)量進(jìn)一步增加，從而擴(kuò)展了后續(xù)穩(wěn)定同位素驗(yàn)證和網(wǎng)絡(luò)分析所面對(duì)的候選數(shù)據(jù)空間。
從方法學(xué)角度看，隨著可檢測(cè)特征數(shù)量和數(shù)據(jù)復(fù)雜度不斷增加，后續(xù)數(shù)據(jù)解析的重要性也隨之提升：如何從更加豐富而復(fù)雜的檢測(cè)信號(hào)中提取可驗(yàn)證、可歸并、可解釋的代謝物信息，正在成為深度代謝組學(xué)的重要課題。TRACE 所采用的穩(wěn)定同位素約束與全局網(wǎng)絡(luò)推斷，為這一過程提供了一種具有代表性的分析思路。
從同位素“富集”到“稀釋”：解析營養(yǎng)競爭
在完成生物來源代謝物驗(yàn)證后，TRACE 進(jìn)一步用于營養(yǎng)競爭條件下的代謝流向分析。
傳統(tǒng)穩(wěn)定同位素示蹤通常通過加入標(biāo)記底物，觀察同位素在下游代謝物中的出現(xiàn)或富集；TRACE 則采用反向思路。研究人員首先讓酵母在 ¹³C-葡萄糖和 ¹?N-硫酸銨標(biāo)記背景中生長，隨后分別加入未標(biāo)記的亮氨酸、蘇氨酸、色氨酸、腺嘌呤、尿嘧啶、乙酸鹽或 14 種化合物混合物。當(dāng)這些未標(biāo)記營養(yǎng)物被細(xì)胞吸收并參與代謝時(shí)，會(huì)稀釋原本來自 ¹³C-葡萄糖和 ¹?N-硫酸銨的標(biāo)記。
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因此，TRACE 關(guān)注的是既有 ¹³C/¹?N 標(biāo)記被未標(biāo)記營養(yǎng)物稀釋的程度。通過比較營養(yǎng)物補(bǔ)充組與對(duì)照組的標(biāo)記變化，可以評(píng)估不同外源營養(yǎng)物在既定標(biāo)記碳、氮背景下的攝取利用及其代謝去向。
研究發(fā)現(xiàn)，乙酸鹽主要表現(xiàn)出 C2N0、C4N0 和 C6N0 的碳貢獻(xiàn)模式，與其以 C2 單元進(jìn)入中心碳代謝的方式一致；蘇氨酸主要貢獻(xiàn) C4N1，腺嘌呤則表現(xiàn)出顯著的 C5N5 貢獻(xiàn)模式。這些同位素稀釋特征與相應(yīng)營養(yǎng)物的化學(xué)組成和已知代謝途徑高度一致。
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進(jìn)一步以谷胱甘肽(GSH)和 NAD+ 為模型，研究分別驗(yàn)證了 TRACE 對(duì)不同復(fù)雜度代謝網(wǎng)絡(luò)的解析能力。GSH 作為相對(duì)線性的組裝模型，其同位素模式能夠?qū)?yīng)組成氨基酸的碳、氮來源，驗(yàn)證了 TRACE 對(duì)直接前體摻入關(guān)系的解析能力；NAD+ 則作為多通路匯聚模型，進(jìn)一步展示了 TRACE 對(duì)嘌呤補(bǔ)救與從頭合成、色氨酸代謝以及谷氨酰胺來源氮等多源貢獻(xiàn)的解析能力。
TRACE 通過同位素稀釋解析不同營養(yǎng)物的碳、氮去向，并分別以 GSH 和 NAD+ 驗(yàn)證線性組裝與復(fù)雜匯聚代謝網(wǎng)絡(luò)。(點(diǎn)擊查看大圖)
從“峰列表”走向“功能代謝網(wǎng)絡(luò)”
總體而言，TRACE 將穩(wěn)定同位素示蹤、動(dòng)態(tài)誤差校準(zhǔn)、全局峰網(wǎng)絡(luò)和營養(yǎng)競爭分析整合到統(tǒng)一框架中，實(shí)現(xiàn)了從代謝特征檢測(cè)、生物來源驗(yàn)證到營養(yǎng)流向解析的連續(xù)分析。研究還在 Q Exactive Plus、Orbitrap Exploris 480、Orbitrap Astral 、Orbitrap Ascend Tribrid和 Orbitrap Excedion Pro等多個(gè)高分辨質(zhì)譜平臺(tái)上開展了跨平臺(tái)比較，展示了穩(wěn)定同位素信息與高分辨質(zhì)譜檢測(cè)能力結(jié)合在深度代謝組學(xué)研究中的應(yīng)用潛力。
該研究表明，穩(wěn)定同位素不僅可以用于追蹤代謝物中的元素去向，還能夠作為實(shí)驗(yàn)約束條件輔助非靶向 LC-MS 特征歸屬。在此基礎(chǔ)上，TRACE 進(jìn)一步將代謝物驗(yàn)證與營養(yǎng)來源解析連接起來，為從復(fù)雜質(zhì)譜特征中構(gòu)建具有生物學(xué)意義的代謝關(guān)系網(wǎng)絡(luò)提供了一種實(shí)驗(yàn)與計(jì)算相結(jié)合的方法學(xué)框架。
作者信息：
中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所李銳博士后為論文第一作者，楊立峰研究員與中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院王琳研究員為論文通訊作者。研究得到科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程、中國科學(xué)院上海分院人才計(jì)劃等的資助，同時(shí)得到中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所所級(jí)公共技術(shù)中心、賽默飛世爾科技質(zhì)譜技術(shù)支持以及中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)的支撐。
論文信息：Li R, Wang J, Shan Y, et al. TRACE: An Integrated Isotope-Tracing Framework for Metabolite Validation and Nutrient Fate Mapping. Analytical Chemistry, 2026. DOI:10.1021/acs.analchem.6c02292.
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