魚(yú)皮膠原蛋白肽生產(chǎn)線酶法

酶法提取是指可溶性膠原和酸溶性膠原被提取后，需用一些蛋白酶，如膠原酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和鹽析后膠原蛋白電泳圖譜胰凝乳蛋白酶等水解，得到不同的酶促溶性膠原蛋白。所使用的蛋白酶主要分3種：動(dòng)物蛋白酶（如胰蛋白酶，胃蛋白酶），植物蛋白酶（如木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶），微生物蛋白酶（如堿性蛋白酶，中性蛋白酶）。在對(duì)酶法水解膠原蛋白的研究中，以堿性蛋白酶應(yīng)用zui多。將膠原進(jìn)行限制性降解，即將末端肽切割下來(lái)，由于膠原肽鏈間的共價(jià)鍵都是通過(guò)分子末端肽里的賴(lài)氨酸或羥賴(lài)氨酸的相互 作用形成的，末端肽被切下后，含三螺旋結(jié)構(gòu)的主體部分可溶于稀有機(jī)酸而被提取出來(lái)。用酶處理，可以水解掉膠原纖維蛋白的末端肽，提高膠原蛋白的產(chǎn)率；而且 還不會(huì)破壞膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，保持其特性。影響酶提取的因素有很多，如酶濃度、酶與底物的比例、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值以及料液比等。在實(shí)際操 作中，大多數(shù)采用酶復(fù)合法提取膠原蛋白，較多的是使用胃蛋白酶提取，有機(jī)酸多為乙酸。

魚(yú)皮膠原蛋白肽生產(chǎn)線酶解膠原蛋白的工藝

主要分為單酶水解法和多酶水解法。多酶水解法又分為混合酶水解法（比如牛胰蛋白酶，鏈霉菌蛋白酶，芽孢桿菌蛋白酶混合）和分步酶水解胃蛋白酶提取膠原蛋白的電泳圖譜法， 酶法提取皮膠原具體實(shí)驗(yàn)工藝及條件的選取通常應(yīng)考慮要開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品對(duì)分子量的要求，要得到分子量較小的膠原多肽一般采用多酶水解法。影響酶解效果的因素主要 有：酶的種類(lèi)、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值及料水比。采用酶法提取骨料中的膠原蛋白，既能有效縮短提取時(shí)間，又能獲得具有良好生物活性的膠原蛋 白，而且對(duì)環(huán)境的污染也較小。膠原蛋白不易被普通蛋白酶水解，但能被動(dòng)物膠原酶斷裂，斷裂的碎片自動(dòng)變性后可被普通蛋白酶水解。胃蛋白酶水解膠原蛋白的適 宜條件為pH 1.65～1.70、溫度37℃。有人以豬骨為原料，用蛋白酶的酶解反應(yīng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)制膠工藝，對(duì)骨膠原的酶解反應(yīng)與酶法制膠工藝進(jìn)行了試驗(yàn)研究。結(jié)果表 明：以胃蛋白酶對(duì)骨膠原的提取率zui高（46.14%），其次是胰蛋白酶（43.42%），接下來(lái)是中性蛋白酶（30.14%），zui后是堿性蛋白酶 （21.15%）。并且通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)胃蛋白酶酶解反應(yīng)中各主要影響因素進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，胃蛋白酶提取的*條件是，胃蛋白酶的濃度是 1%，在pH2.0的條件下酶解48h，然后在濃度為10%（w/v）的NaCL溶液中鹽析24h，zui后骨膠原的回收率為64.77%，骨膠原的提取率為 49.75%。還有人用胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白，分別在水解0、2、6、10、14、18、22、26h時(shí)對(duì)四種不同胃蛋白酶用量（分別為1%、2%、 2.5%、3%）的試樣取樣檢測(cè)，采用一階HILL方程模擬胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白的進(jìn)程以及胃蛋白酶水解速率的衰減過(guò)程，zui后得出2%的胃蛋白酶用量 和6-7h的水解時(shí)間提取率zui大。還有人用以新鮮豬皮為原料，在50-52℃的條件下用胰酶進(jìn)行水解，在酶用量為 5000：1～10000：1，pH值為9，反應(yīng)2－3h，原料：水為1：2的條件下酶解。結(jié)果表明：總蛋白質(zhì)的提取率≥80%。

采用酶法提取膠原蛋白時(shí)，必須嚴(yán)格控制提取條件。

首先，酶作用時(shí)間必須適當(dāng)。如果時(shí)間過(guò)短，膠原蛋白，就不能充分釋放到提取液中，影響提取率；如果酶作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，膠原蛋白會(huì)水解過(guò)度，產(chǎn)生過(guò)多的苦味小分子低聚肽，不僅會(huì)增加分離純化的難度，也會(huì)影響膠原 蛋白的功能特性和生物活性。其次，酶解溫度要適宜。溫度過(guò)低，酶的作用效果不明顯；溫度過(guò)高會(huì)引起酶的失活和膠原蛋白的變性。據(jù)報(bào)道，當(dāng)介質(zhì)pH略低于中 性時(shí)，膠原蛋白的變性溫度為40～41℃，當(dāng)介質(zhì)pH為酸性時(shí)，膠原蛋白的變性溫度為38～39℃，而且魚(yú)皮膠原蛋白的變性溫度要比豬皮膠原蛋白的變性溫 度低7～12℃。所以，如果要使提取的膠原蛋白具有良好的生物活性，在提取過(guò)程中應(yīng)使提取溫度低于變性溫度。第三，需選用適當(dāng)?shù)拿浮Ｒ话銖年懮溉閯?dòng)物組 織中提取膠原蛋白時(shí)，采用胃蛋白酶在其zui適作用溫度下進(jìn)行提取是合理的，但對(duì)于魚(yú)類(lèi)等水生動(dòng)物，由于其膠原蛋白的變性溫度比陸生哺乳動(dòng)物低，因此許多蛋白 酶便不適用，如果在這些酶的zui適作用溫度下提取可能會(huì)破壞膠原蛋白的某些功能特性和生物活性。采用酶法提取膠原蛋白及其多肽的研究主要是從動(dòng)物皮及其加工 副產(chǎn)物中，應(yīng)用酶法從動(dòng)物骨中提取膠原蛋白及其多肽報(bào)道較少。

純化

可用于膠原蛋白的純化方法包括鹽析法、透析法、離心法、電泳法和色譜法，其中鹽析法、離心法和電泳法zui為常用。由于單一方法難以*分離純化膠原蛋白，實(shí)際 操作都是通過(guò)復(fù)合法來(lái)達(dá)到分離純化膠原蛋白的目的。鹽析法一般采用高濃度NaCl；離心法常選用制備型低溫超速離心機(jī)；電泳法多采用十二烷基*聚丙烯 酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE），該法既可用于膠原蛋白的分離純化，還可用來(lái)測(cè)定膠原蛋白分子的相對(duì)分子質(zhì)量。像有人用破碎、酶解、鹽析三步法提純蘇 尼特羊骨骼I型膠原蛋白。先去除骨頭里的非膠原物質(zhì)，然后往沉淀中10%的胃蛋白酶，在4℃的條件下消化24h，以14000r/min離心40min。 棄沉淀往上清液中加NaCL，使它終濃度達(dá)到0.9moL/L，靜止過(guò)夜，再離心，zui后的沉淀就是I型膠原蛋白。