BUNSEN技術(shù)分享：ELISA實驗中緩沖溶液等試劑的配置

　　所有試劑配置全程使用無熱源、無內(nèi)毒素的去離子水，所有pH值誤差控制在±0.05范圍內(nèi)，從根源上避免因試劑偏差導(dǎo)致的實驗背景偏高、信號不均問題。

　　1. 包被緩沖液(pH 9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液)

　　精準(zhǔn)配方：稱取?1.59g無水碳酸鈉? + ?2.93g碳酸氫鈉?，加去離子水溶解后定容至1000mL，微調(diào)pH至9.6。

　　配置要點：該緩沖液疏水表面更利于蛋白吸附，是ELISA包被的金標(biāo)準(zhǔn)體系，4℃密封可保存1個月，若出現(xiàn)渾濁需立即重新配制。

　　適配場景：絕大多數(shù)抗原/抗體的固相包被，若目標(biāo)蛋白對高pH敏感，可替換為pH7.6的0.01M磷酸鹽緩沖液替代。

　　2. 洗滌緩沖液(pH 7.4 PBST)

　　精準(zhǔn)配方：稱取?8.0g NaCl? + ?0.2g KCl? + ?2.9g Na?HPO?·12H?O? + ?0.2g KH?PO??，溶解后加入?0.5mL Tween-20?，定容至1000mL，調(diào)pH至7.4。

　　配置要點：Tween-20濃度嚴(yán)格控制在0.05%，濃度過高會破壞已結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物，濃度過低則無法洗去非特異性吸附;室溫密封可保存3個月，若出現(xiàn)鹽結(jié)晶，37℃水浴溶解后再使用。

　　3. 樣本/抗體稀釋液

　　基礎(chǔ)配方：稱取?1g BSA?，溶于100mL上述PBST緩沖液中，配制成1% BSA稀釋液。

　　配置要點：磷酸化蛋白檢測絕對禁止使用脫脂奶粉作為稀釋成分(奶粉含磷酸化酶會干擾結(jié)果);普通檢測可替換為5%脫脂奶粉-PBST，進(jìn)一步降低非特異性背景，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　4. 底物緩沖液(pH 5.0 檸檬酸-磷酸緩沖液)

　　精準(zhǔn)配方：提前配制A液(0.1M檸檬酸：21.01g一水合檸檬酸定容至1000mL)、B液(0.2M Na?HPO?：71.63g十二水合磷酸氫二鈉定容至1000mL);取A液24.3mL + B液25.7mL，加去離子水定容至100mL，調(diào)pH至5.0。

　　配置要點：該緩沖液是HRP酶促反應(yīng)的pH環(huán)境，4℃密封可保存2個月，使用前需提前恢復(fù)至室溫。

　　5. TMB顯色工作液

　　精準(zhǔn)配方：取?0.5mL TMB母液(10mg/5mL無水乙醇)? + ?10mL pH5.5底物緩沖液? + ?32μL 0.75% H?O??，充分混勻。

　　配置要點：必須?現(xiàn)配現(xiàn)用、全程避光?，H?O?需使用新鮮開啟的試劑，避免氧化失效導(dǎo)致顯色極弱;配好后1小時內(nèi)必須使用完畢。

　　6. 終止液(2M H?SO?)

　　精準(zhǔn)配方：量取?178.3mL去離子水?，緩慢逐滴加入?21.7mL 98%濃liu酸?，邊加邊攪拌冷卻，混勻后室溫保存。

　　配置要點：嚴(yán)格遵循“酸入水”操作順序，絕對禁止將水倒入濃liu酸中，避免液體飛濺造成安全事故。

　　試劑配置核心避坑要點

　　所有試劑配置完成后，必須標(biāo)注配置日期、有效期，使用前確認(rèn)無渾濁、長菌、結(jié)晶析出等異常情況。

　　濃縮型商品化洗滌液稀釋時，必須嚴(yán)格按照說明書比例用去離子水稀釋，禁止用自來水或普通蒸餾水替代，避免引入雜質(zhì)干擾反應(yīng)。

　　凍干標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶時，在冰上操作，靜置5-10分鐘后輕柔渦旋混勻，禁止劇烈吹打，避免蛋白變性;復(fù)溶后分裝為單次使用量，-20℃凍存，絕對禁止反復(fù)凍融。

　　注：以上科研產(chǎn)品資料供參考!

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