不同ELISA方法的具體操作流程是什么

　　不同ELISA方法的操作流程差異體現(xiàn)在加樣順序、孵育環(huán)節(jié)和信號(hào)邏輯上，以下是4種主流ELISA方法的具體操作流程：

　　一、雙抗體夾心ELISA操作流程

　　包被?：將特異性捕獲抗體稀釋至工作濃度，每孔加100μL，4℃過(guò)夜孵育，完成后洗板3次。

　　封閉?：每孔加200μL 5% BSA封閉液，37℃封閉1小時(shí)，洗板3次拍干。

　　加樣孵育?：依次加入梯度標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，每孔100μL，37℃孵育1~2小時(shí)，洗板5次。

　　加檢測(cè)抗體?：加入HRP標(biāo)記的特異性檢測(cè)抗體，每孔100μL，37℃孵育1小時(shí)，洗板5次。

　　顯色終止?：每孔加100μL TMB底物，室溫避光顯色15分鐘，加50μL 2M H?SO?終止反應(yīng)。

　　讀數(shù)?：15分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀讀取450nm波長(zhǎng)下的OD值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣本濃度。

　　二、間接ELISA操作流程

　　包被?：將純化的目標(biāo)抗原稀釋至工作濃度，每孔100μL，4℃過(guò)夜孵育，洗板3次。

　　封閉?：每孔加200μL封閉液，37℃封閉1小時(shí)，洗板3次拍干。

　　加一抗孵育?：加入梯度稀釋的待檢血清樣本，每孔100μL，37℃孵育1小時(shí)，洗板5次。

　　加酶標(biāo)二抗?：加入HRP標(biāo)記的抗種屬二抗，每孔100μL，37℃孵育30分鐘，洗板5次。

　　顯色終止?：加入TMB底物避光顯色10~15分鐘，加終止液終止反應(yīng)。

　　讀數(shù)?：450nm波長(zhǎng)讀取OD值，判斷待檢抗體的效價(jià)水平。

　　三、競(jìng)爭(zhēng)ELISA操作流程

　　包被?：將目標(biāo)抗原包被至酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜孵育后洗板3次。

　　封閉?：37℃封閉1小時(shí)，洗板3次拍干。

　　競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)?：同時(shí)加入待測(cè)樣本和HRP標(biāo)記的已知抗原，樣本中的游離抗原與標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相上的抗體，37℃孵育1小時(shí)，洗板5次。

　　顯色終止?：加入TMB底物避光顯色，加終止液終止反應(yīng)。

　　讀數(shù)?：450nm波長(zhǎng)讀取OD值，OD值越低代表樣本中目標(biāo)抗原濃度越高。

　　四、直接ELISA操作流程

　　包被?：將待測(cè)抗原樣本直接包被至酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜孵育后洗板3次。

　　封閉?：37℃封閉1小時(shí)，洗板3次拍干。

　　加酶標(biāo)抗體?：直接加入HRP標(biāo)記的特異性一抗，37℃孵育1小時(shí)，洗板5次。

　　顯色終止?：加入底物顯色后終止反應(yīng)，直接讀數(shù)完成檢測(cè)。

　　注：以上資料僅供參考，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說(shuō)明或咨詢(xún)技術(shù)老師。

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