ELISA實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟是什么

　　ELISA實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟以包被、封閉、加樣孵育、洗滌、加酶標(biāo)抗體、顯色、終止、讀數(shù)為核心流程，不同檢測(cè)類(lèi)型的操作細(xì)節(jié)略有差異，以下是通用全流程規(guī)范：

　　一、通用基礎(chǔ)操作步驟

　　包被?

　　將捕獲抗體或抗原用包被液稀釋至1-10μg/mL工作濃度，每孔加入100μL。

　　選擇4℃過(guò)夜孵育12-16小時(shí)，或37℃孵育1-2小時(shí)完成固相吸附。

　　封閉?

　　每孔加入200-300μL封閉液(1%-5% BSA或5%脫脂牛奶)。

　　室溫孵育1-2小時(shí)，封閉板孔未結(jié)合的空白位點(diǎn)，避免后續(xù)出現(xiàn)非特異性吸附。

　　加樣孵育?

　　加入梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，每孔100μL。

　　37℃孵育1-2小時(shí)，讓目標(biāo)分子與包被物充分發(fā)生特異性免疫結(jié)合。

　　洗滌?

　　倒掉孔內(nèi)液體，每孔加入300μL PBST洗滌液，靜置30秒后甩掉液體并在吸水紙上拍干。本生Elisa試劑盒

　　重復(fù)該操作3-5次，去除所有未結(jié)合的游離物質(zhì)。

　　加酶標(biāo)抗體?

　　加入酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體或二抗，每孔100μL。

　　37℃孵育30分鐘-1小時(shí)，完成酶標(biāo)物的特異性結(jié)合，之后再次重復(fù)3-5次洗滌操作。

　　顯色與終止?

　　每孔加入100μL TMB底物溶液，室溫避光顯色15-30分鐘。

　　觀察最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔變?yōu)樯钏{(lán)色后，每孔加入50μL 2M硫酸終止液，此時(shí)藍(lán)色會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定黃色。

　　讀數(shù)與結(jié)果分析?

　　加終止液后15-30分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下讀取各孔吸光度OD值。本生Elisa試劑盒

　　以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入樣本OD值即可計(jì)算出待測(cè)物的實(shí)際濃度。

　　二、不同ELISA類(lèi)型的操作差異

　　間接法?：包被抗原→加待檢血清一抗→加酶標(biāo)二抗→顯色，多用于抗體類(lèi)檢測(cè)。

　　雙抗體夾心法?：包被捕獲抗體→加抗原樣本→加檢測(cè)抗體→加酶標(biāo)二抗→顯色，適合微量蛋白檢測(cè)。

　　競(jìng)爭(zhēng)法?：樣本抗原與標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，最終信號(hào)越弱代表樣本中目標(biāo)物濃度越高，適配小分子抗原檢測(cè)。

　　三、關(guān)鍵操作注意事項(xiàng)

　　洗滌必須充分，次數(shù)不足會(huì)導(dǎo)致背景值偏高，洗滌過(guò)度則會(huì)造成信號(hào)偏弱，需嚴(yán)格按規(guī)范操作。

　　每次加樣必須更換新吸嘴，避免交叉污染;試劑從冰箱取出后需先平衡至室溫再使用，樣本不可反復(fù)凍融。

　　實(shí)驗(yàn)必須同步設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，所有待測(cè)樣本建議做一式二份平行樣，保障結(jié)果準(zhǔn)確性。

　　TMB底物對(duì)光敏感，需全程避光保存和操作，顯色過(guò)程動(dòng)態(tài)觀察，以最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔的顏色變化作為終止判斷依據(jù)。

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