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圖 1.（A）A201A 的生物合成基因簇的組織結(jié)構(gòu)；（B）A201A 的化學(xué)結(jié)構(gòu)；（C）變位酶 MtdL 催化 GDP- 吡喃半乳糖和 GDP- 呋喃半乳糖之間的可逆反應(yīng)；（D）A201A 的生物合成途徑中糖的后修飾過程。

近日，中國科學(xué)院南海海洋所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室鞠建華研究團隊，在科學(xué)期刊《美國國家科學(xué)院院刊》（PNAS）上，發(fā)表了深海微生物來源的抗生素 A201A 研究的重要突破成果：Deciphering the sugar biosynthetic pathway and tailoring steps of nucleoside antibiotic A201A unveils a GDP-l-galactose mutase（PNAS, 2017, 114, 4948-4953）。 論文報道了 A201A 糖基結(jié)構(gòu)單元的生物合成和后修飾過程，發(fā)現(xiàn)并闡明了一個新穎的 l - 半乳糖吡喃 - 呋喃型變位酶 MtdL。mtdL 基因是一個有效的遺傳標(biāo)記，對指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)自然界中包含 l - 呋喃半乳糖結(jié)構(gòu)單元的活性天然產(chǎn)物具有重要指導(dǎo)意義。

自然界中的半乳糖（galactose,Gal）有 d - 和 l - 兩種構(gòu)型，以六元吡喃糖環(huán)（pyranose) 型和五元呋喃型糖環(huán)（furanose) 兩種形式存在，因此具有四種異構(gòu)體。哺乳動物中的 d -Gal 只有 d - 吡喃型 (d-galactopyranose, d-Galp)，而在細(xì)菌、真菌、原生動物以及一些病原生物中常以 d - 呋喃糖 (d-galactofuranose, d-Galf) 形式存在，并與毒力和致病性有著密切關(guān)系。與 d -Gal 的廣泛存在相比，l-Gal 作為維生素 C 合成的重要前體，在自然界中還較少被發(fā)現(xiàn)。目前呋喃型的 l -Galf 在小分子天然產(chǎn)物、動物細(xì)胞、植物組織、仔豬、蜂膠、靈芝多糖中被檢測到，人們對催化 l -Galf 生物合成的酶并不清楚。

前期工作中，科研人員從深海來源的放線菌中分離得到核苷類抗生素 A201A，通過基因組測序和基因敲除等手段鑒定了 A201A 的生物合成基因簇，并闡明一個負(fù)調(diào)控基因 MtdA (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2012, 56(1):110-114) 的功能?？股?A201A 由氨基核苷、α- 甲基桂皮酸、含不飽和雙鍵的呋喃己糖和含α-d- 鼠李糖四個結(jié)構(gòu)單元組成（圖 1A）。A201A 對 G + 菌和大多數(shù)厭氧性 G - 菌具顯著的抗菌活性，通過作用于核糖體 A 位點抑制蛋白質(zhì)的合成。

研究人員進一步對 A201A 糖基結(jié)構(gòu)單元的生物合成和后修飾過程進行了剖析。首先通過在異源宿主 Streptmyces lividans TK64 中對基因簇進行異源表達(dá)確定了其邊界（圖 1A），接著通過對 18 個生物合成基因進行系列阻斷，突變株產(chǎn)生了 10 個新結(jié)構(gòu)衍生物（圖 1D）。進一步結(jié)合同位素標(biāo)記的前體喂養(yǎng)、體外酶促反應(yīng)實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶 MtdG1 對底物的識別具有一定的寬泛性，能夠裝配 GDP-a-d- 甘露糖和 GDP-a-d- 鼠李糖到 A201A 骨架上；MtdL 在二價陽離子 Mn2+ 或 Mg2+ 存在的情況下，能夠可逆催化 GDP-β-l-Galp 轉(zhuǎn)化成 GDP-a-l-Galf，是自然界中發(fā)現(xiàn)的吡喃糖 - 呋喃糖基變位酶（圖 1C）；通過對 MtdL 進行氨基酸定點突變確證 Asp109、Asp111 和 Arg159 是對其活性負(fù)責(zé)的關(guān)鍵氨基酸殘基。

A201A 生物合成的后修飾過程由四個甲基轉(zhuǎn)移酶 MtdM1、MtdM2、MtdM3 和 MtdM4 以及一個脫氫酶 MtdW 參與：MtdM1 負(fù)責(zé) A201A 中 3'- 氨基 -3'- 脫氧腺苷結(jié)構(gòu)單元的 N, N- 二甲基化； MtdM2 和 MtdM3 分別負(fù)責(zé) A201A 中α-d- 鼠李糖結(jié)構(gòu)單元 OH-C-4'和 OH-C-3' 的 O - 甲基化；MtdM4 負(fù)責(zé) L - 半乳呋喃糖結(jié)構(gòu)單元中 OH-C-5' 的 O - 甲基化；MtdW 是一類新穎的脫氫氧化酶，負(fù)責(zé) L - 半乳呋喃糖結(jié)構(gòu)單元中 C -4/C- 5 的脫飽和作用。四個甲基轉(zhuǎn)移酶和脫氫酶具有嚴(yán)格的區(qū)域選擇性和較為寬泛的底物識別性（圖 1D）。科研人員對采用生物合成技術(shù)獲得的新結(jié)構(gòu)衍生物進行了抗菌活性篩選，得到了藥效相當(dāng)?shù)苄缘玫教岣叩乃幬锵葘?dǎo)化合物 des-N,N-dimethyl-A201A