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RNA具有堿基對(duì)的特性，形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)是其多樣性功能的基礎(chǔ)。在近期的Cell上發(fā)表的一篇文章里，美國(guó)斯坦福的研究人員開發(fā)了一種叫PARIS的新方法。這是一種在活細(xì)胞中以可逆的補(bǔ)骨脂素交聯(lián)的方式，近乎于堿基對(duì)的分辨率整體繪制RNA雙鏈圖譜的方法。
由于遠(yuǎn)距離結(jié)構(gòu)、偽結(jié)合、可選擇性結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列和RNA-RNA相互作用的存在，推斷活細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)尤其具有挑戰(zhàn)性。顯示這些困難的一個(gè)例子就是XIST 。XIST是一個(gè)對(duì)于哺乳動(dòng)物X染色體失活*的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，跨越數(shù)千堿基，折疊成進(jìn)化上保守的RNA結(jié)構(gòu)域。目前已提出了多個(gè)結(jié)構(gòu)模型。對(duì)于XIST與關(guān)鍵伙伴蛋白如SPEN之間互作的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)也不清楚。
RNA親和捕獲和鄰位連接技術(shù)能識(shí)別RNA堿基對(duì)，目前的方法受特定的蛋白或RNA誘餌的限制，只能一個(gè)時(shí)間實(shí)施一次并且在更長(zhǎng)的RNA上有局限性。這篇Cell中的新方法能夠直接識(shí)別活細(xì)胞的堿基對(duì)配對(duì)相互作用，確定RNA結(jié)構(gòu)和RNA-RNA相互作用。
PARIS(補(bǔ)骨脂素交聯(lián)分析RNA相互作用和結(jié)構(gòu))包含了幾個(gè)關(guān)鍵步驟：體內(nèi)交聯(lián)、RNA雙鏈的2D純化以及鄰位連接，顯示了的敏感性和特異性，并由許多已知的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化保守性所證實(shí)。
該研究在三種人類和小鼠細(xì)胞類型中進(jìn)行PARIS分析，揭示了轉(zhuǎn)錄組中常見的遠(yuǎn)距離結(jié)構(gòu)、高階結(jié)構(gòu)和RNA-RNA反式相互作用。PARIS在單分子的水平上確定了堿基對(duì)的相互作用，揭示了普遍的可選擇性構(gòu)象。PARIS決定的結(jié)果包含很多雙鏈RNA結(jié)合蛋白(STAU1,DICER1, DGCR8等)的靶標(biāo)。此外，高置信度的結(jié)構(gòu)帶來了RNA結(jié)構(gòu)系統(tǒng)進(jìn)化分析的兩個(gè)新方法，揭示了看家基因mRNA的保守結(jié)構(gòu)。
研究人員運(yùn)用PARIS決定的螺旋來指導(dǎo)RNA結(jié)構(gòu)的進(jìn)化系統(tǒng)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一些保守的遠(yuǎn)距離結(jié)構(gòu)和可選擇性結(jié)構(gòu)。
聯(lián)合采用PARIS，icSHAPE（體內(nèi)點(diǎn)選2’羥基酰化和圖譜分析實(shí)驗(yàn)），系統(tǒng)進(jìn)化分析和iCLIP（單個(gè)核苷酸分辨率的紫外交聯(lián)和免疫沉淀）揭示了XIST的lncRNA總體結(jié)構(gòu)，顯示XIST的A重復(fù)形成復(fù)雜的互相重復(fù)的雙鏈，以關(guān)鍵表觀沉默蛋白SPEN為核進(jìn)行高階裝配。
總的來說PARIS是一個(gè)普遍使用和靈活的方法，為RNA結(jié)構(gòu)組合學(xué)和相互作用組學(xué)提供了新的見解。PARIS和相關(guān)方法的優(yōu)勢(shì)是能夠促進(jìn)發(fā)現(xiàn)高階的lncRNA結(jié)構(gòu)。
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