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細(xì)胞的凍存方法

2012-9-20　

　　細(xì)胞的凍存方法
　　
　　一個實驗室得到一個新的細(xì)胞株后，首先要把該細(xì)胞株培養(yǎng)擴(kuò)增后凍存起來。細(xì)胞凍存首先可以在由于污染等情況丟失細(xì)胞時有備份可用，另外幾乎所有細(xì)胞在培養(yǎng)傳代的過程中發(fā)生一定程度的變異，為了保持實驗結(jié)果的一致，一般細(xì)胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能再使用了，需要將凍存的，傳代較少的細(xì)胞化凍培養(yǎng)再使用。
　　
　　細(xì)胞冷凍過程有四個要點：細(xì)胞的收獲、保護(hù)劑的使用、冷凍速率和儲存環(huán)境。
　　
　　在這里給大家簡述下這個四個要點：
　　
　　細(xì)胞的收獲
　　
　　用來凍存的細(xì)胞一般選擇在細(xì)胞約鋪滿90%的時候，這時細(xì)胞生長狀態(tài)好，細(xì)胞數(shù)量也多，并且在收獲細(xì)胞前24小時換一次培養(yǎng)液。收獲用來凍存的細(xì)胞開始時方法和平時一樣，用100xg離心5分鐘收集細(xì)胞再重懸，活細(xì)胞記數(shù)。稀釋或濃縮到細(xì)胞保存的zui終細(xì)胞濃度的二倍（一般是400-1000萬細(xì)胞/ml），加入已經(jīng)配好的等體積的培養(yǎng)液保護(hù)劑混合溶液中輕輕混勻，分裝到凍存管，冷凍保存。
　　
　　保護(hù)劑的使用
　　
　　細(xì)胞凍存中，一般使用DMSO作為保護(hù)劑。在細(xì)胞凍存中，DMSO使用的zui終濃度一般是5-15%，某種具體細(xì)胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。對特別敏感的細(xì)胞特別是雜交瘤細(xì)胞在凍存時使用95%血清和5%DMSO可能會好些。保護(hù)劑在使用時先用培養(yǎng)液或血清配成zui終濃度的2倍，再與等體積的懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液混合。
　　
　　細(xì)胞凍存的速率
　　
　　細(xì)胞的冷凍速率zui是控制在讓細(xì)胞有足夠的時間脫水而又不被過度脫水導(dǎo)細(xì)胞損害。對大多數(shù)細(xì)胞來說，每分鐘降1至3℃是合適的。通常的操作是把細(xì)胞先在-20℃1-2個小時，再放入-80℃冰箱過夜（如果沒有-80℃冰箱，可以用干冰替代），再轉(zhuǎn)入液氮罐或低于-130℃的冰箱長期保存。
　　
　　另外一個辦法是，在-20℃1-2個小時以后，把冷凍管懸掉在液氮罐的氣相中，以控制冷卻的速率。這個方法比較簡單，因為細(xì)胞也可以在液氮罐的氣態(tài)中長期保留，所以不用計時。對于沒有-80℃冰箱，或者購買干冰不方便的人來說，這是一個比較好的辦法。
　　
　　儲存環(huán)境
　　
　　細(xì)胞長期保存溫度是-130℃或更低。液氮罐中氣態(tài)層溫度在-140℃至-180℃之間，細(xì)胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能保存在氣態(tài)層，因為這樣可避免由于有液氮進(jìn)入凍存管而在拿出細(xì)胞時引起爆炸（但是這樣液氮罐內(nèi)只能存儲少量液氮，需要經(jīng)常添加）。細(xì)胞也可以在-80℃冰箱保存幾個月左右的時間。

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