無菌檢查問答-2010版中國藥典培訓(xùn) 無菌檢查法系指檢查藥品、敷料、縫合線、無菌器具及適用于藥典要求無菌檢查的其他品種是否無菌的一種方法。 無菌檢查在潔凈度100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行，其全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,防止微生物污染。單向流空氣區(qū)與工作臺面，必須進行潔凈度驗證。 生物制品的無菌檢查，應(yīng)按《中國生物制品規(guī)程》中有關(guān)無菌檢查的規(guī)定辦理。 

1、 供試品傳入無菌，對表面進行消毒。用75%無菌酒精浸泡表面是否可行？可用如何方法。（等紫外照射1h 酒精噴射，是否可行？注：無緩沖間的情況。從一般區(qū)直接進入傳遞窗）

答：用75%無菌酒精浸泡表面應(yīng)該可行，但酒精易燃。   可用普通消毒劑如新潔爾滅等消毒。

2、無菌實驗供試品在傳入無菌傳遞窗前能否泡消毒液？   

答：視包裝而定。如：玻璃安瓿，可以；西林瓶，不可以。

3、檢驗針劑時，安瓿表面消毒可否用碘液浸泡作為消毒，如果可以，它會殺死樣品本身的微生物嗎？

答：我們沒有碘液浸泡消毒的經(jīng)驗。  就浸泡方式而言，視包裝而定，如：玻璃安瓿，可以；西林瓶，不可以。

4、微生物檢查樣品傳遞消毒處理，需作驗證嗎?如何確定其消毒效果？

答：驗證當(dāng)然，但也應(yīng)結(jié)合常識、經(jīng)驗等，盡量減低工作量。

5、藥典要求只要供試品的特性允許優(yōu)先考慮薄膜過濾法。對于小劑量無抑菌作用的注射劑，是直接接種法好還是薄膜過濾法好？

答：優(yōu)先考慮薄膜過濾法，可視樣品包裝情況而定。

6、無菌檢查驗證，2010年版方法改變，變換了大腸埃希桿菌，請問從前經(jīng)過驗證的無菌檢查方法，實施2010年藥典時是否必須從新的驗證方法進行驗證？驗證后從能進行無菌檢查？  

答：應(yīng)重新驗證。

8、無菌制劑的處方與工藝都沒有改變，10版藥典出版是否還需重新驗證？

答：10版用大腸埃希替代銅綠假單胞，應(yīng)重新驗證。

9、05版我們已經(jīng)做了方法驗證，10版還要再做方法驗證嗎？

答：如前所述。

10、做陽性對照，為什么同是做5批檢樣，到zui后只是兩到三批長菌？原因出在哪？濾膜嗎？（我們是做抗菌素的產(chǎn)品） 

答：原因是多方面的。請考慮方法的耐用性；此外，操作前后是否一致（比如：供試品溶液溶解是否*、供試品溶液的濃度是否一致、對濾膜濾筒的濕潤、每次過濾對濾筒的蕩洗、抽干、抽干是否過久等等）等等都有可能是影響因素。

11、清潔無菌室所用消毒液如何做到無菌拖把、拖桶如何做到無菌？

答：消毒液可采用過濾的方法。無菌拖把、拖桶可采用浸泡、高溫滅菌的方法。

12、微生物的操作記錄，可否直接用電子版進行記錄。也就是將操作結(jié)果及過程記錄在電子系統(tǒng)內(nèi)？如細菌培養(yǎng)時間為72小時，在操作規(guī)程上可否寫成為72±2小時。生產(chǎn)企業(yè)可否將有菌種的檢查項目，如方法學(xué)驗證、培養(yǎng)基適用性檢查委托有資格的單位檢驗？   

答：可直接用電子版進行記錄。  細菌培養(yǎng)時間為72小時，建議在操作規(guī)程上寫成為72小時。    生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)該可將有菌種的檢查項目，如方法學(xué)驗證、培養(yǎng)基適用性檢查委托有資質(zhì)的單位檢驗。

13、高壓消毒爐的培訓(xùn)一般在哪里有舉行？

答：廣州：特種設(shè)備培訓(xùn)機構(gòu)鍋爐所  

14、化妝品微控的容器洗滌一般用什么洗滌較好？ 

答：表面活性劑

15、貴所日常所用的消毒液是哪些？

答：新潔爾滅、消毒粉、75%酒精、來蘇兒。

16、消毒液本來就是用來消毒殺菌的，又怎么會存在消毒液是否無菌這一說法？ 

答：消毒液不是的，對絕大對數(shù)菌有效，不排除對有些微生物無效。  有些消毒劑質(zhì)量難保證，如果有效成分濃度過低甚至無，則達不到滅菌效果。

17、能否直接用電磁爐煮培養(yǎng)基（加熱）？*加熱方法是？ 

答：電磁爐不能加熱玻璃瓶。我們所：水浴（100℃），微波爐。   

18、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基培養(yǎng)后會有點渾濁（排除是菌生長），是否可以在滅菌之前過濾培養(yǎng)基?

答：找出培養(yǎng)基混濁的原因，若是培養(yǎng)基與樣品發(fā)生作用導(dǎo)致的混濁，滅菌之前過濾培養(yǎng)基也是沒用的。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基含瓊脂，如果用濾膜，一般很難過濾；如果用紗布、棉花、濾紙等，則須考慮濾材對不同成分的吸附程度不同，可能造成培養(yǎng)基成分比例的改變。

19、方法驗證時：對照加的菌液是zui后才加嗎？   

答：按藥典，在zui后一次沖洗液中加入。

20、培養(yǎng)基適用性檢查無菌性檢查中“每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支（瓶））中”中“每批”指脫水商品培養(yǎng)基的生產(chǎn)批次，還是指制備的批次？

答：指制備批次的培養(yǎng)基。

21、微生物檢驗用的各種試劑除了化學(xué)純，能否使用分析純？

答：可以。

22、生物安全柜，凈化操作臺每年是否需要檢定？ 

答：是的，我所是每年檢定一次。并定期檢測潔凈度，頻次自己制訂。

23、無菌操作時，對顯微鏡硬件條件的需求是怎樣？  

答：顯微鏡：至少1000X，也就說要有油鏡。

24、生產(chǎn)原料藥的公司，其微生物檢測方法采用限度檢查法，請問潔凈室的劃分中還需要建立“無菌檢查室”嗎？  

答：只要滿足藥典規(guī)定的萬級背景下的局部百級即可。

25、陽性接種室，有沒有硬性要求在萬級區(qū)域局部百級區(qū)域？

答：無硬性要求。但應(yīng)使用生物安全柜，并按生物安全柜的要求設(shè)置外圍空間。

26、陽性操作間的空調(diào)系統(tǒng)是否應(yīng)與微生物限度檢查的空調(diào)系統(tǒng)*分開，若未分開，是否可以采取直排的方式？（不利用陽性間的空調(diào)回風(fēng)）

答：應(yīng)分開。直排不等于分開。

27、微生物限度實驗室和陽性對照室的潔凈系統(tǒng)要分別獨立，如用同一套的HVAC，但都是全排，是否能接受？   

答：應(yīng)分開。直排不等于分開。

28、微生物與無菌潔凈系統(tǒng)也一定分別設(shè)置嗎？   

答：有條件將微生物限度檢查與無菌檢查潔凈系統(tǒng)分開。

29、潔凈區(qū)監(jiān)控中，某些設(shè)備不宜采用沖淋法和接觸碟法取樣，而擦拭法中棉簽釋放率很低（普通棉簽釋放率只有20%左右）。請問如何設(shè)計采樣方法才能真實反映設(shè)備表面微生物情況？ 

答：有些國外生產(chǎn)微生物檢驗儀器的大公司，有的小拭子，可能更有效。

30、用潔凈服材質(zhì)做成袋子來代替牛皮紙的包扎滅菌是否可行？

答：我們所目前采用此法。

31、環(huán)境監(jiān)測用平皿預(yù)培養(yǎng)溫度和時間?

答：30-35℃，時間不少于48h 。

32、靈敏度檢測如何確定接種菌數(shù)量？

答：菌液在接種至靈敏度檢測用培養(yǎng)基的同時用微生物限度檢查法的平皿法測定每1ml菌液的cfu。

33、如何驗證消毒劑消毒效果？   

答：目前沒有統(tǒng)一的方法，自行設(shè)計。

34、消毒劑消毒效果如何驗證？如何設(shè)定SAL接受標(biāo)準(zhǔn)？  

答：目前沒有統(tǒng)一的方法，自行設(shè)計。

35、驗證試驗中，若供試品需加入β-內(nèi)酰胺酶，那么陽性對照管是否應(yīng)該加入等量β-內(nèi)酰胺酶？ 

答：驗證試驗時，不加，因為對照管是用于比較試驗菌生長情況的。    檢驗時的陽性對照則加。

 36、全封閉式無菌驗證中，用0.9%Nacl溶液溶解后，抽入集菌器中，樣品溶液是否要停留幾秒鐘？讓樣品與濾膜充分接觸或者停留后溶液造成抗生素殘角？如何停留幾秒鐘？應(yīng)在100ml時停留還是50ml時停留合適？  

答：不應(yīng)停留，應(yīng)讓樣品盡快通過，避免抑菌成分被吸附。薄膜過濾法的目的是僅讓微生物截留在濾膜上。

37、每張濾膜每次沖洗量一般100ml，總沖洗量不得超過1000ml，若供試品容量較大，總供試品樣品量按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定超過1000ml，那這種情況應(yīng)如何看待呢？  

答：中國藥典未規(guī)定供試品溶液的體積，設(shè)計檢驗方法時，兼顧供試品溶液的濃度和體積，盡量采用較小的體積。

38、裝消毒劑的容器是否要求滅菌？例如用可滅菌的不銹鋼材質(zhì)，因為塑料的容器不能滅菌問題。 

答：應(yīng)該滅菌。

39、配制用水zui長可以放置多久？ 

答：視放置條件，經(jīng)驗證，自己設(shè)定。

40、對滅菌效果進行驗證，多久進行一次？

答：根據(jù)自己工作情況，自己制訂。  

41、微生物限度檢查時所用吸管是否均需計量？   

答：無規(guī)定。

42、無菌，微生物限度實驗，樣品與陽性對照可以共用一個培養(yǎng)箱嗎？

答：有2種意見：其一，條件許可，分開，以免污染；其二，共用一個培養(yǎng)箱，使其在相同條件下培養(yǎng)。  我們：分開。

43、在無菌檢查項下，供試品檢驗時，陽性對照是否必須每批都需做？是否供試品無菌試驗跟陽性對照必須同步操作？

答：ChP要，同步。

44、生產(chǎn)企業(yè)一次生產(chǎn)80mg/瓶的凍干粉36000瓶，企業(yè)取20瓶做無菌檢驗，是否應(yīng)另增加10瓶做陽性試驗？（方法：薄膜過濾法，濾膜三分法，一份陽性，另兩份置兩種不同培養(yǎng)基中。

答：是，總共需30瓶。

45、培養(yǎng)基靈敏度試驗所用的菌種有6種，為什么沒有大腸？

答：有專家解釋：因銅綠與大腸均為革蘭氏陰性桿菌，而銅綠在醫(yī)院及自然界中更廣泛存在，致病性更強。

45、如果產(chǎn)品經(jīng)無菌驗證后，是以大腸為對照菌時，可行嗎？

答：如果驗證6種菌均可行，建議按藥典陽性對照章節(jié)的要求，設(shè)定陽性對照菌。如果驗證結(jié)果樣品是抗革蘭陰性菌的，則陽性菌應(yīng)用大腸埃希菌。

46、靈敏度試驗可要加入大腸？

答：否。  

47、薄膜過濾法中，菌懸液的加入，在zui后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾，這個說法用封閉式過濾器（）要如何做？如果做法是加入培養(yǎng)基后，再從管子里加1ml的100cfu的菌，可行嗎？

答：在zui后一次沖洗液中，經(jīng)封閉式過濾器頂部的透氣孔加入1ml的少于100cfu的菌液，抽干，再加培養(yǎng)基。

48、"全封閉式無菌檢驗中，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml，我們驗證的是50ml*3 100ml*3，總沖洗量不超1000ml,可行嗎？"

答：可行。

49、《中國藥典》無菌檢查方法驗證中“菌種加在zui后一次沖洗液中，過濾”，如果某供試品無菌檢查方法無需進行沖洗，那么菌懸液應(yīng)該加在哪合適？

答：藥典無規(guī)定，可在過濾完樣品后直接加菌液，然后加入培養(yǎng)基。

50、"無菌驗證后，試驗菌數(shù)經(jīng)測定，若加入菌數(shù)大于100cfu,該情況如何處理？是否需要判斷其試驗無效，重新驗證" 

答：重新驗證。

51、南方天氣濕度大，易發(fā)霉，毛巾或者衣服上可能有黑色的霉點洗不干凈，請問有沒有好的方法去除霉點？   

答：漂白、消毒。

52、粉針注射劑，同一個品種有不同規(guī)格的產(chǎn)品，在建立方法學(xué)驗證時是否每個規(guī)格都需要進行驗證？

答：理論上，以zui大規(guī)格建立的方法應(yīng)適用于其他較小規(guī)格。   但這樣做可能會提高成本，因小規(guī)格的沖洗量、滅活劑等用量可能可以更少，難以一概而論。

53、無菌檢查方法中陰性對照，每瓶溶劑，稀釋液，沖洗液都需要收集，是不是每做一批試驗，都需同時操作兩臺集菌儀？陰性對照能否每一批溶劑，稀釋液，沖洗液抽一、兩瓶做陰性對照？  

答：不一定每做一批試驗，都需同時操作兩臺集菌儀。  陰性對照不應(yīng)該僅僅每一批溶劑，稀釋液，沖洗液抽一、兩瓶做陰性對照，應(yīng)盡可能將所用到的每瓶都留少量做陰性。

54、"每一張膜總沖洗量不得超過1000ml,這個總沖洗量包括樣品溶液嗎？"

答：不包括。

55、無菌性檢查，培養(yǎng)基是直接拿去培養(yǎng)，還是按照說明書滅菌處理后再拿去培養(yǎng)？  

答：成品培養(yǎng)基直接培養(yǎng)；脫水培養(yǎng)基或自己配制的培養(yǎng)基滅菌后拿去培養(yǎng)。

56、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（中檢所）極易被氧化，藥檢所做實驗時是將管裝量定在多高？

答：我們所用的是全封閉一次性濾筒，裝量100ml，高度約6.5cm。

57、如果培養(yǎng)過程氧化層高度已超過藥典中要求的1/2高度，并發(fā)現(xiàn)其中長菌，結(jié)果如何判定？若未長菌，結(jié)果判定認為無菌是否成立？此類問題應(yīng)該如何衡量？   

答：如果培養(yǎng)過程氧化層高度已超過藥典中要求的1/2高度，并發(fā)現(xiàn)其中長菌，可判斷為不合格；    若未長菌，按藥典，結(jié)果判定認為無菌應(yīng)不成立；  此類問題應(yīng)該照藥典執(zhí)行，培養(yǎng)后不超過1/2高度。

58、“無菌性檢查中每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支（瓶）”,這句話中的“5支（瓶）”是5支或5瓶，還是5支和5瓶？” 

答：或

59、潔凈區(qū)與陽性實驗室空調(diào)系統(tǒng)應(yīng)如何分別設(shè)置？送風(fēng)分離，回風(fēng)分離，或兩者均分離？即2套空調(diào)系統(tǒng)？

答：2套系統(tǒng)互不相干。

60、十四烷酸異丙酯若經(jīng)驗證后，不影響陽性菌生長，可否濕熱滅菌？

答：濕熱滅菌的水蒸氣可能會影響十四烷酸異丙酯的性能，建議按藥典。

61、沖洗液的濾清，加入不渾濁，是否可不用過濾？  

答：可

62、無菌檢查時，陽性對照的接種與培養(yǎng)是否也必須和供試品培養(yǎng)同一天進行？   

答：應(yīng)同步操作。

63、使用的消毒劑應(yīng)無菌，比如購買的新潔而滅要用無菌的4.5微米濾膜過濾再用嗎？

答：如用在關(guān)鍵地方，建議過濾。

64、產(chǎn)品穩(wěn)定性考察，有無菌檢查項目，請問留樣產(chǎn)品的無菌檢查的數(shù)量和常規(guī)檢查的數(shù)量要一樣嗎？如果是，留樣量就會相當(dāng)大，有的藥品比較貴重，這樣會造成企業(yè)較大的損失. 

答：無菌檢查的數(shù)量和常規(guī)檢查的數(shù)量應(yīng)一樣。  按藥典穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則附表，該做就應(yīng)做，但若情況特殊，或許可減低檢驗頻次，但如此一來，可能一些藥品注冊審評專家或GMP檢查員會有不同意見。穩(wěn)定性試驗的無菌檢查很大程度是在考察包裝。

65、 做培養(yǎng)基適用性與方法驗證時，若加菌量為100~120cfu＞100cfu，是否需要重新做驗證？

答：要。

66、 藥典只是提供了化藥中干擾物的中和劑方法，能否提供一些中成藥的除菌方法？ 

答：無

67、潔凈區(qū)污染霉菌怎么處理？ 

答：可嘗試甲醛熏蒸

68、潔凈區(qū)有霉菌生長，要怎么凈化環(huán)境？注：我們用75%的乙醇抹洗全部空間，然后開臭氧半小時，但是檢測后還是發(fā)現(xiàn)有霉菌，老師是不是還有更好的方法？

答：可嘗試甲醛熏蒸

69、老師說的酒精棉過一段時間會生長細菌，請問酒精棉保存期多久？

答：未考察，我們使用期一般不超過一周。

70、酒精棉怎樣取樣進行微生物檢查？

答：請自行設(shè)計

71、酒精棉有規(guī)定超過多少的菌數(shù)不能再用？ 

答：無規(guī)定。

72、廣州環(huán)凱有凍干菌粉賣，是否可以在其單位購買？

答：建議向中檢所購買。

73、請問藥典說“當(dāng)產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，應(yīng)對檢驗方法重新驗證”，如何理解“原檢驗條件發(fā)生改變”

答：比如，將沖洗量500ml改為300ml，等等。

74、靈敏度檢查：改良馬丁和硫乙醇酸性流體培養(yǎng)基都要做6種菌株嗎？  

答：硫乙醇：4種，為金葡、銅綠、枯草、生孢；  馬丁：2種，為百念、黑曲。

75、清潔后的潔具需用微生物純化水洗滌？

答：清潔后的潔具需用純化水洗滌。

76、無菌：陽性對照培養(yǎng)48~72小時就可以滅活了嗎？不用跟供試品培養(yǎng)14天嗎？

答：是的

77、供試品處理時，需加入適量的聚山梨酯80，聚山梨酯80需要滅菌嗎？方法如何？ 

答：需滅菌，可采用濕熱滅菌。

78、含0.05%（v∕v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液如何配制？

答：可直接用聚山梨酯80配制，或先配制聚山梨酯80的濃溶液，然后取濃溶液作進一步配制。

79、如何證明“表面活性劑，中和劑或滅活劑使用應(yīng)有效性及對微生物無毒性”？

答：自行設(shè)計

80、抗生素效價室放在潔凈室里面是否合適？ 

答：應(yīng)與潔凈區(qū)分開。

81、zui后滅菌產(chǎn)品的原輔料是否需要做微生物限度檢查？  

答；一般情況應(yīng)做。

82、薄膜過濾法若試驗沖洗量1000ml陽性用量多少？

答：也1000ml。

83、無菌用培養(yǎng)基是否不用對照培養(yǎng)基？

答：是

84、無菌檢查法從開始制樣到加入培養(yǎng)基也不能超過1h嗎？  

答：一般情況應(yīng)該如此。

85、薄膜過濾法濾膜若＞50mm，沖洗量是否需調(diào)整？如何調(diào)整？   

答：建議按藥典規(guī)定，選用直徑約50mm的濾膜。如要調(diào)整，即重新驗證。

86、陽性菌接種使用生物安全柜后，那接種室的空調(diào)系統(tǒng)能否與微生物限度檢查室共用？如果現(xiàn)在共用了，有什么方法能避免交叉污染？

答：請掌握原則，凈化系統(tǒng)應(yīng)分開。      

87、怎么消毒在試驗中要用的無菌溫度計？

答：我們沒有這方面的經(jīng)驗。

88、發(fā)酵分裝容器要預(yù)先滅菌，請問分裝時是否有要求在無菌的環(huán)境下進行，分裝后再進行滅菌，程序是否復(fù)雜化？

答：我們不明白該問題，一般而言，既然容器要預(yù)先滅菌，分裝也應(yīng)無菌操作。

89、無菌檢查用的菌懸液是否必須用新鮮培養(yǎng)制備？用于制備菌懸液的培養(yǎng)物可否在25℃條件下連續(xù)使用一周？

答：請按藥典10版要求，否則，自己驗證。

90、飲用水檢測中GB標(biāo)準(zhǔn)中“總大腸菌群檢出應(yīng)進一步檢驗大腸埃希菌或耐熱大腸菌群”，是否可以只做大腸埃希菌？

答：我們目前尚未開展水質(zhì)檢驗。

   無菌檢查問答-2010版中國藥典培訓(xùn) 無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料、及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定,僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。
    無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度 10 000 級下的局部潔凈度 100 級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行，其全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進行潔凈度驗證。隔離系統(tǒng)應(yīng)按相關(guān)的要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。
    無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)。