【微課堂】環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑芽孢計數(shù)方法

時間：2024/8/27

《藥品GMP指南》生物指示劑的應用中指出，實驗室在接受商品化生物指示劑時，應進行微生物數(shù)量測定。

那么，環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑的總芽孢數(shù)是如何確定的呢？接下來為大家分享泰林環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑（Bacillus atrophaeus ATCC9372）的芽孢計數(shù)方法。

環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑芽孢計數(shù)—操作方法

隨機抽取需檢驗批次環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑取4片（支）放置于提前照過紫外的生物安全柜中（相關(guān)物品已放置于生物安全柜中），用酒精棉擦拭指示劑外表，通風15min以上，后續(xù)操作如下：

注意：生物指示劑不要進行紫外照射，可能會造成計數(shù)結(jié)果偏低?。?！

01 芽孢洗脫

在生物安全柜中，取4片（支）生物指示劑打開，取出載體，分別放置于含有3-4顆玻璃珠（直徑6mm）的無菌試管中，向無菌試管中加入3mL的含0.1%聚山梨酯80的無菌純化水，置于渦旋混勻儀上充分振蕩，將試管中載體打散成纖維裝后，再中加入7mL含0.1%聚山梨酯80的無菌純化水，震蕩30s，制成均一的菌懸液，將該試管記為10^-1。

02 熱激活

將水浴鍋加熱至80℃-85℃，取上述試管，放置于水浴鍋中熱激活10min，熱激完成后，立即將芽孢懸液轉(zhuǎn)移至0-4℃的冰水浴中冷卻至室溫。

03 梯度稀釋

將該試管轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，于旋渦混勻儀上旋渦30s，用移液槍吸取1mL芽孢懸液，加入到另一根含有9mL含0.1%聚山梨酯80的無菌純化水的試管中，記為10^-2，按照該方法依次稀釋至10^-3、10^-4（稀釋級別按制造商提供的芽孢數(shù)量而定）。

04 制備計數(shù)平皿

取芽孢數(shù)在30cfu/mL-300cfu/mL的稀釋級別的試管（10^-4）震蕩30s，每支稀釋管平行制備2個平皿，每皿加1mL菌懸液，注入15mL-20mL溫度不超過45℃融化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）。等待瓊脂凝固后，倒置于30℃-35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h-72h后計數(shù)。