科諾美 Frontier 生物惰性液相，攻克寡核苷酸 ASO 分析瓶頸

時(shí)間：2026/9/18

寡核苷酸藥物（Oligonucleotide Drugs）是一類(lèi)以寡核苷酸為基礎(chǔ)的治療藥物，主要用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)或干擾與疾病相關(guān)的RNA分子功能。其中，反義寡核苷酸（ASO）作為技術(shù)成熟、應(yīng)用廣泛的核酸藥物，全球年銷(xiāo)售額就達(dá)到約32億美元，成為基因治療領(lǐng)域的重要支柱。因此，對(duì)寡核苷酸進(jìn)行高靈敏度和穩(wěn)定的定性定量分析變得越來(lái)越重要。LC-MS/MS由于其優(yōu)異的選擇性和高靈敏度可為寡核苷酸定量分析提供有效幫助。然而ASO硫代骨架是強(qiáng)負(fù)電，大分子易金屬螯合，容易產(chǎn)生強(qiáng)非特異性吸附，導(dǎo)致LC-MS/MS殘留大，高濃度進(jìn)樣后，后續(xù)空白持續(xù)出峰。針對(duì)寡核苷酸藥物在色譜端殘留大的問(wèn)題，科諾美推出Frontier生物惰性超高效液相色譜系統(tǒng)（Frontier Bio Inert LC），該系統(tǒng)與質(zhì)譜儀聯(lián)用，可以大大減少乃至消除非特異性吸附，有效提高檢測(cè)精準(zhǔn)度；無(wú)需鈍化處理系統(tǒng)，提高儀器使用效率，為寡核苷酸藥物測(cè)定提供優(yōu)質(zhì)解決方案。

實(shí)驗(yàn)部分

儀器設(shè)備：Frontier Bio Inert LC 聯(lián)用 SCIEX 5500+ MS/MS

色譜條件

液相方法：

色譜柱：KINETEX 2.6μm EVO C18 100? 50*2.1mm

流動(dòng)相：A：水(0.15%DIEA+0.7%HFIP)；

流動(dòng)相：B：乙腈(0.15%DIEA+0.7%HFIP)

梯度洗脫：0.01-3.0min，5%B-30%B；3.0-5.0min，30%B-100%B；5.0-5.9min，100%B。

流速：0.3mL/min

柱溫：40℃

進(jìn)樣量：5μL

質(zhì)譜方法：

數(shù)據(jù)采集方法：MRM（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）

離子源：ESI負(fù)模式

氣簾氣CUR：35psi IS電壓：5500V

源溫度TEM：550℃ 霧化氣GS1：50psi

輔助氣GS2：50psi 碰撞氣CAD：high

表1 寡核苷酸（ASO）的MRM離子對(duì)信息

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Carryover測(cè)試結(jié)果對(duì)比

按照空白-500ng/mL-空白1-空白2的進(jìn)樣順序編輯序列，運(yùn)行結(jié)束后根據(jù)目標(biāo)峰的峰面積計(jì)算500ng/mL濃度之后的第一針和第二針空白的殘留水平，結(jié)果如表2所示。 Bio inert系統(tǒng)新增多種自動(dòng)進(jìn)樣器清洗方式，通過(guò)增加針清洗和閥清洗等方式殘留可降至0.1%以?xún)?nèi)。

表2 生物惰性Frontier Bio Inert 不同進(jìn)樣器清洗程序儀器殘留對(duì)比表（以峰面積計(jì)算）

圖1 寡核苷酸的提取離子流圖（XIC）

圖2 寡核苷酸（ID-1）500ng/mL以及空白1殘留圖

圖3 寡核苷酸（ID-2）500ng/mL以及空白1殘留圖

圖4 寡核苷酸（ID-3）500ng/mL以及空白1殘留圖

圖5 寡核苷酸（ID-4）500ng/mL以及空白1殘留圖

線(xiàn)性

將適量寡核苷酸（ASO）用處理后的大鼠血清上清液稀釋成濃度為1.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，50.0ng/mL，100.0ng/mL，200ng/mL，500ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)樣分析。寡核苷酸線(xiàn)性結(jié)果如圖4所示，在1.0ng/mL~500ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，r2均大于0.999。

圖6 寡核苷酸（ASO）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)結(jié)果

重現(xiàn)性

將100ng/mL的寡核苷酸（ASO）樣品連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行重復(fù)性考察。保留時(shí)間重復(fù)性在0.24%-0.26%之間，峰面積重復(fù)性在0.84%-1.30%之間。（圖7-圖10）。

圖7 寡核苷酸ASO（ID-1）100ng/mL連續(xù)6針重復(fù)性結(jié)果表

圖8 寡核苷酸ASO（ID-2）100ng/mL連續(xù)6針重復(fù)性結(jié)果表

圖9 寡核苷酸ASO（ID-3）100ng/mL連續(xù)6針重復(fù)性結(jié)果表

圖10 寡核苷酸ASO（ID-4）100ng/mL連續(xù)6針重復(fù)性結(jié)果表

結(jié)論

本方案采用科諾美生物惰性超高效液相色譜系統(tǒng)Frontier Bio Inert LC，該系統(tǒng)與質(zhì)譜儀聯(lián)用，采用新的自動(dòng)進(jìn)樣器清洗方式，有效降低寡核苷酸非特異性吸附，線(xiàn)性最高點(diǎn)500ng/mL后空白殘留在0.1%以?xún)?nèi)，在濃度范圍1ng/mL-500ng/mL內(nèi)線(xiàn)性良好，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)大于0.999，重復(fù)性好，滿(mǎn)足寡核苷酸藥物的精準(zhǔn)測(cè)定。

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