Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit
細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒
產(chǎn)品簡介：
細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是一種采用經(jīng)典的碘化丙啶染色(Propidium Iodide staining)方法進行細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡分析。
碘化丙啶(Propidium Iodide，簡稱PI)是一種雙鏈DNA的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進行DNA含量測定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，可以進行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析。
細(xì)胞發(fā)生凋亡時，由于胞漿和染色質(zhì)濃縮、核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體，使細(xì)胞的光散射性質(zhì)發(fā)生變化。在細(xì)胞凋亡的早期，細(xì)胞對前向角光散射的能力顯著降低，對側(cè)向光散射的能力增加或沒有變化。在細(xì)胞凋亡的晚期，前向和側(cè)向光散射的信號均降低。因此可通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞光散射的變化觀察細(xì)胞凋亡情況。
本試劑盒通常應(yīng)用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細(xì)胞的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測。如果用于組織的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測，則必須把組織消化成單細(xì)胞狀態(tài)，才可以進行檢測。
本試劑盒足夠檢測50個樣品，每個樣品的細(xì)胞數(shù)量可以為10-100萬。
產(chǎn)品組成：
組分 | 規(guī)格 |
染色緩沖液 | 25ml |
碘化丙啶染色液(20×) | 1.25mL |
RNase A(50×) | 0.5ml |
使用方法：
1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：細(xì)胞數(shù)量控制在1×105~1×106個。
A．貼壁細(xì)胞：小心吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用胰酶消化細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。1000 g離心5 min，沉淀細(xì)胞，棄上清，用1 mL預(yù)冷的PBS潤洗細(xì)胞一次，離心收集細(xì)胞。
B．懸浮細(xì)胞：1000 g離心5 min，沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。加入1 mL預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心收集細(xì)胞。
C．組織細(xì)胞：將組織塊用剪刀剪成盡量小的小塊后，用0.25%的胰酶消化0.5-1 h，經(jīng)過200-400目篩網(wǎng)過濾得到單細(xì)胞懸液。1000 g離心5 min，沉淀細(xì)胞。加入約1 mL預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞。如組織難以消化，可加入適量膠原酶。
2. 細(xì)胞固定：
細(xì)胞沉淀用1 mL預(yù)冷的70%乙醇輕輕混勻，4℃固定2 h以上或者過夜。然后1000 g左右離心5 min沉淀細(xì)胞后，小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的70%乙醇，以避免吸走細(xì)胞。
加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸。然后再次1000g離心5 min沉淀細(xì)胞。小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團。
3. 碘化丙啶染色液的配制：
對于1個樣品，在0.5 mL染色緩沖液中加入25μl碘化丙啶染色液（20×）和10μl RNase A（50×），混勻待用。其它數(shù)量的樣品參考下表，根據(jù)待檢測樣品的數(shù)量配制適量的碘化丙啶染色液：
| | 1個樣品 | 6個樣品 | 12個樣品 |
染色緩沖液 | 0.5mL | 3mL | 6mL |
碘化丙啶染色液(20×) | 25μl | 150μl | 300μl |
RNase A(50×) | 10μl | 60μl | 120μl |
Final volume | 0.535mL | 3.21mL | 6.42mL |
注：配制好的碘化丙啶染色液短時間內(nèi)可以4℃保存，*好當(dāng)日使用。
4. 染色：
每管細(xì)胞樣品中加入0.5ml碘化丙啶染色液，輕輕混勻重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光孵育30分鐘，就可以進行流式檢測，流式檢測*好在5h內(nèi)完成。
5. 流式檢測和分析：
用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用適當(dāng)分析軟件進行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。
注意事項：
- 本試劑盒需要使用流式細(xì)胞儀進行檢測；需自備PBS和70%乙醇。
- 細(xì)胞需輕柔處理，盡量避免人為損傷細(xì)胞。
- 為防止不同批次細(xì)胞在實驗時所處周期不同導(dǎo)致重復(fù)性差，可以在實驗前進行細(xì)胞的同步化處理。實驗細(xì)胞應(yīng)處于對數(shù)生長期，貼壁細(xì)胞一般在50～80%匯合度時收集為宜。
- 400目篩網(wǎng)過濾是用來將粘在一起的細(xì)胞團濾掉，留下單細(xì)胞，否則會出現(xiàn)人為的多倍體干擾。如果沒有條件過濾，請在染色之前將細(xì)胞輕彈以分散，再進行染色。
- 熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
- 碘化丙啶對人體有刺激性，操作碘化丙啶時，應(yīng)注意防護，保護眼睛、避免吸入。
- 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。。
保存條件：
-20℃避光保存，有效期兩年。
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