利用斑馬魚模型評價肺炎防治作用【評價原理】

斑馬魚的鰾從器官進化、組織結(jié)構(gòu)以及生物學等多個層面都類似于哺乳動物的肺泡。我們與浙江大學公共衛(wèi)生學院從事慢阻肺研究的團隊合作，進行魚鰾損傷模型與肺損傷相關(guān)性研究。我們發(fā)現(xiàn)細微顆粒、細菌、腫瘤細胞以及肺炎患者的灌洗液都會引起斑馬魚鰾損傷，產(chǎn)生嚴重的炎癥反應(yīng)，甚至導致斑馬魚鰾破裂。通過我們所做的機制方面的研究及實驗證明，斑馬魚模型可以作為急性肺損傷研究的新模型，進而可以用于肺損傷治療或者預(yù)防的有關(guān)藥物的篩選。

（1）細菌性肺炎：注射給予LPS建立斑馬魚肺炎模型。LPS是脂質(zhì)和多糖的復(fù)合物，來源于革蘭氏陰性菌細胞壁的外膜，是內(nèi)毒素的主要成分。接觸一定量的LPS會引起機體支氣管炎、肺炎、肝炎及脂多糖血癥。

（2）病毒性肺炎：注射給予聚肌胞——poly（i:c）建立斑馬魚肺炎模型。poly（i:c）的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)非常類似于病毒或病毒復(fù)制過程中形成的雙鏈RNA，所以poly（i:c）類似某些病毒，具有很強的干擾素誘生作用。

通過使用轉(zhuǎn)基因中性粒細胞綠色熒光斑馬魚，在熒光顯微鏡下可以直接觀察斑馬魚中性粒細胞，使用實時熒光定量PCR儀可獲得基因表達水平，通過制作組織病理切片觀察斑馬魚魚鰾部位的病理結(jié)構(gòu)變化。

利用斑馬魚模型評價肺炎防治作用【實驗方案】

（1）我們將受測試斑馬魚分成三組，分別是正常對照組、模型對照組和抗肺炎藥物組。其中，模型對照組與抗肺炎藥物都注射了等量的LPS建立肺炎模型。抗肺炎藥物在注射了LPS的同時攝入吲哚美辛之類的抗肺炎藥物。

（2）我們將受測試斑馬魚分成三組，分別是正常對照組、模型對照組和抗肺炎藥物組。其中，模型對照組與抗肺炎藥物都注射了等量的聚肌胞——poly（i:c）建立肺炎模型?？狗窝姿幬镌谧⑸淞藀oly（i:c）的同時攝入吲哚美辛之類的抗肺炎藥物。

服用一段時間抗肺炎藥物后，我們在熒光顯微鏡下拍攝斑馬魚中性粒細胞，用實時熒光定量PCR儀檢測TNF-α、IL-1β值，同時制作成病理切片觀察魚鰾部位的病理結(jié)構(gòu)變化。

【結(jié)果展示】

圖1. 斑馬魚中性粒表型圖

黃色虛線區(qū)域為魚鰾，綠色熒光顆粒為中性粒細胞

可以看到，服用抗肺炎藥物組斑馬魚魚鰾位置處的中性粒細胞與正常對照組相似，未出現(xiàn)模型對照組中性粒細胞明顯增多的情況。

圖2. TNF-α、IL-1β基因表達水平

與模型對照組比較，***p < 0.001

可以看到，服用抗肺炎藥物組斑馬魚的炎癥基因表達水平與正常對照組較為接近，未出現(xiàn)模型對照組炎癥基因的表達水平明顯升高的情況。

圖3. 魚鰾部位病理切片

從病理切片中也能看出來，服用抗肺炎藥物組斑馬魚魚鰾病理結(jié)構(gòu)與正常對照組相似，未出現(xiàn)模型對照組滲入的中性粒細胞數(shù)的情況。

【評價結(jié)論】

1.經(jīng)過每組30尾斑馬魚的對比實驗，服用抗肺炎藥物在中性粒細胞、炎癥基因表達和病理結(jié)構(gòu)均與正常對照組相似，未出現(xiàn)模型對照組的中性粒細胞數(shù)顯著增加炎癥基因表達水平明顯升高和病理出現(xiàn)中性粒細胞滲出的情況。

2.本實驗證實了吲哚美辛具有顯著的防治肺炎作用。