菲羅門(mén)  ACE C18-PFP 色譜柱

探索ACE C18-PFP色譜柱的優(yōu)勢(shì)： 
一種*的C18鍵合HPLC色譜柱， 具有五氟苯基（PFP）相的額外選擇性 ? 

• 將C18和PFP分離機(jī)制相結(jié)合來(lái)分li任一單獨(dú)相不可能實(shí)現(xiàn)分離的混合物

• 改善極性堿性化合物的保留以獲得更佳的分離效果

• 超惰性、超高純度硅膠具有的峰形和可重現(xiàn)性

• 為高溫應(yīng)用提供的鍵合相穩(wěn)定性

• 超低流失相可以確保UV和LC/MS的兼容性

• 可獲得高通量色譜柱尺寸

為什么需要另一種新的C18相？
使用超純、超惰性硅膠具有許多*的優(yōu)點(diǎn)，包括改善可重現(xiàn)性、壽命和色譜性能（特別是堿性分子）。

然而，由于超惰性硅膠表面不再有效促進(jìn)分離，所以用高純度硅膠制造的C18柱可以顯示出接近相同的選擇性。

因此，通過(guò)改用替代制造商的同等產(chǎn)品，一個(gè)*品牌的問(wèn)題分離很可能不會(huì)得到顯著改善。
多年來(lái)，經(jīng)驗(yàn)豐富的色譜學(xué)家們一直在尋求由這樣*的C18色譜柱品牌展示的、具有可靠性能和可重現(xiàn)性?xún)?yōu)點(diǎn)的相，但另外也為他們的挑戰(zhàn)性應(yīng)用提供了所需的替代選擇性。

ACE C18-PFP 色譜柱有何不同？
C18鍵合相目前主導(dǎo)著HPLC市場(chǎng)，近的調(diào)查顯示，它們?nèi)匀徽紦?jù)了所有HPLC色譜柱銷(xiāo)售量的50-60％。

近年來(lái)，由于其提供的替代選擇性，五氟苯基（PFP）鍵合相的使用顯著增長(zhǎng)。
然而，與C18鍵合相相比，PFP相傳統(tǒng)上受疏水性降低、穩(wěn)定性降低和顯著柱流失的影響。
ACE C18-PFP相利用一種特別開(kāi)發(fā)的配體，將C18鏈與完整PFP官能團(tuán)相結(jié)合，形成可以保持*C18相的疏水性、穩(wěn)定性和低流失特性的相，同時(shí)也提供了PFP相的多重保留機(jī)制以實(shí)現(xiàn)ACE C18-PFP色譜柱的*選擇性。
“ACE C18-PFP色譜柱是一種有價(jià)值的方法開(kāi)發(fā)工具 - 是將C18保留性和穩(wěn)定性與PFP選擇性相結(jié)合的色譜柱”
*制藥公司的研發(fā)團(tuán)隊(duì)*

ACE C18-PFP顯示出對(duì)C18鍵合色譜柱的替代選擇性

化合物：1）1,2,3-*氧基苯2）1,2,4-*氧基苯3）1,2-二甲氧基苯

色譜柱150 x 4.6 mm, 5μm

流速：1.00 ml/min

溫度：40°C

檢測(cè)：UV, 254 nm
流動(dòng)相：50:50 v/v 甲醇/水

何時(shí)應(yīng)用ACE C18-PFP？
由于其相似的疏水特性，ACE C18-PFP色譜柱可用于通常會(huì)考慮“標(biāo)準(zhǔn)”C18色譜柱的應(yīng)用中。

然而，由于其完整的五氟苯基官能團(tuán)，ACE C18-PFP還被*用于涉及鹵代芳族化合物、位置異構(gòu)體和具有不同形狀約束的分析物的分離。
本手冊(cè)中包含的應(yīng)用證實(shí)，ACE C18-PFP可用于改善C18色譜柱上存在問(wèn)題的分離。*的ACE C18-PFP相為C18色譜柱提供了替代選擇性，但對(duì)規(guī)定為C18鍵合色譜柱的方法，保留了有效的選擇。

在許多情況下，證實(shí)不適合C18色譜柱的相同評(píng)估條件被證實(shí)適用于C18-PFP色譜柱，這就避免了冗長(zhǎng)的方法再開(kāi)發(fā)。

改善色譜分離度
色譜分離的目標(biāo)是在短的時(shí)間內(nèi)獲得目標(biāo)組分的足夠分離度（Rs）。

1.5的分離度可以實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離，然而對(duì)于可以在實(shí)驗(yàn)室之間易于轉(zhuǎn)換的耐用、可重復(fù)方法而言，理想的分離度是1.8-2.0。
分離度方程告訴我們什么變量可以影響分離度：

增加分離度Rs可以通過(guò)增加N、α或k來(lái)實(shí)現(xiàn)。

然而，如圖1所示，可以看出，增加N或k以改善Rs的回報(bào)率快速下降。

例如，Rs僅隨著N平方根的增加而增加。

可以通過(guò)增加柱長(zhǎng)或降低柱填充材料的粒徑或兩者的某種組合來(lái)增加N。

無(wú)論哪種方式，系統(tǒng)背壓隨著N的增加而增加，因此通過(guò)增加N實(shí)現(xiàn)令人滿(mǎn)意的分離，其“成本”可能是*的壓力。
同樣，增加保留值（k值）將會(huì)增加Rs，但回報(bào)率也快速下降。

將k增加至超過(guò)10通常是Rs與分析時(shí)間之間的不利權(quán)衡，因?yàn)橹挥蠷s的邊際收益隨著保留時(shí)間的增加而實(shí)現(xiàn)。

該效應(yīng)的圖形表示參見(jiàn)下述圖1。

增加α可以增加Rs，但不同于N和k,不會(huì)受回報(bào)率下降的約束。

α的變化對(duì)壓力沒(méi)有影響，對(duì)分離時(shí)間的影響也是微乎其微的（參見(jiàn)圖2）。

因此，在開(kāi)發(fā)分離方法時(shí)，α是重要的變數(shù)。

優(yōu)化α可以使您在所有目標(biāo)峰之間達(dá)到滿(mǎn)意的分離度，同時(shí)保持系統(tǒng)背壓和分離時(shí)間在可接受范圍內(nèi)。

改善色譜分離度 - 選擇性或柱效？
選擇性(α)由流動(dòng)相、溫度和固定相化學(xué)物質(zhì)控制。

大多數(shù)方法開(kāi)發(fā)策略將探索所有這些色譜變量。
如果使用“標(biāo)準(zhǔn)”3μm C18相沒(méi)有達(dá)到足夠的分離度，*優(yōu)化分離的色譜選擇性而不是分離柱效，如下述實(shí)例所示。
通過(guò)簡(jiǎn)單地將固定相化學(xué)物質(zhì)（即色譜柱）改變?yōu)榫哂刑娲V選擇性的固定相化學(xué)物質(zhì)，易于在標(biāo)準(zhǔn)HPLC系統(tǒng)上獲得所需分離度，而無(wú)需昂貴的UHPLC儀器。

另外，也可以避免復(fù)雜的流動(dòng)相組分、升高的溫度和侵蝕性pH條件。

在保持C18鍵合相的同時(shí)，將粒徑從3μm減小至2μm以下，并不能顯著改善分離效果，另外也會(huì)導(dǎo)致壓力明顯增加。
ACE C18-PFP色譜柱為3個(gè)關(guān)鍵對(duì)提供了更佳的選擇性(α)，因此與2μm以下的C18色譜柱相比，其可以提供的分離效果，即使2μm以下的色譜柱可以提供更高的柱效。
與使用具有高塔板數(shù)和高壓的色譜柱嘗試進(jìn)行峰分離所獲得的結(jié)果相比，利用選擇性的能力可以獲得更佳的分離效果。

PFP分離機(jī)制
ACE C18-PFP相顯示有多個(gè)保留機(jī)制，包括疏水性、π-π相互作用、偶極-偶極、氫鍵和形狀選擇性。

雖然下述部分提供了相對(duì)強(qiáng)度的近似值，但每個(gè)保留機(jī)制的優(yōu)勢(shì)由溶質(zhì)的物理/化學(xué)性質(zhì)、其結(jié)構(gòu)和所采用的色譜條件決定。

π-π相互作用

PFP環(huán)在相的表面上加入了芳香特性。

然而，PFP相不同于苯基相，因?yàn)殡娯?fù)性氟原子會(huì)產(chǎn)生缺電子的苯環(huán)，使得PFP相可以作為路易斯酸而起作用。

這將與能夠給出電子的分析物（即路易斯堿）相互作用。
這與苯基相相反，苯基相含有富電子芳香環(huán)（由于不存在吸電子基團(tuán)），因此它們可以作為路易斯堿而起作用。

偶極-偶極和氫鍵

PFP環(huán)中的碳-氟鍵具有強(qiáng)極性。

因此，PFP相可以通過(guò)在分析物與電負(fù)性氟原子之間發(fā)生的偶極-偶極或氫鍵相互作用來(lái)額外保留分析物。

任何這樣的相互作用將導(dǎo)致保留增加。

形狀選擇性

PFP具有剛性環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)與其它可能的保持機(jī)制相結(jié)合時(shí)，可以賦予PFP相優(yōu)異的形狀選擇性。

ACE C18-PFP相顯示有PFP相的多重保留機(jī)制，色譜科學(xué)家們可能會(huì)利用這些機(jī)制來(lái)解決在傳統(tǒng)C18相（僅主要依賴(lài)于疏水保留機(jī)制）上難以分離（即使并非不可能）的混合物。

應(yīng)用#1 取代的甲氧基苯異構(gòu)體- *的C18色譜柱

上述實(shí)例突出了以下事實(shí)：*的C18品牌可以提供相似的選擇性，并且均無(wú)法分離三、二和單甲氧基苯異構(gòu)體。

保留值的差異（如中性參考標(biāo)記所示）是由于純粹的疏水作用并與母體硅膠特性（例如：表面積）相關(guān)。
由于*的ACE C18-PFP配體中包含完整的PFP官能團(tuán)，ACE C18-PFP對(duì)所有組分都表現(xiàn)出的分離度。

應(yīng)用#2 取代的甲氧基苯異構(gòu)體- PFP色譜柱

上述應(yīng)用強(qiáng)調(diào)了五氟苯基相在位置異構(gòu)體分離中的用途。如之前在第5頁(yè)中所示，標(biāo)準(zhǔn)C18相無(wú)法分離出三、二和單甲氧基苯異構(gòu)體。
傳統(tǒng)的PFP相可以提供替代選擇性，但是以疏水性的顯著降低為代價(jià)，這就影響了分離效果。
ACE C18-PFP可以保持C18相的疏水性，并提供的分離效果，從而可以進(jìn)一步優(yōu)化以減少分析時(shí)間。

應(yīng)用#3 取代的*異構(gòu)體

該測(cè)試包含芳香族*異構(gòu)體，在簡(jiǎn)單的等度條件下進(jìn)行，強(qiáng)調(diào)當(dāng)這些相具有相似的疏水性時(shí)，與C18相相比，*異構(gòu)體，C18-PFP相顯示出不同的色譜選擇性（通過(guò)增強(qiáng)的偶極-偶極相互作用）。
C18相不能在這些條件下實(shí)現(xiàn)異構(gòu)體的分離，而C18-PFP由于其完整的PFP官能團(tuán)可以提供額外的保留機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)了所有異構(gòu)體的基線(xiàn)分離。

應(yīng)用#4 藥學(xué)相關(guān)分析物

上述應(yīng)用顯示在ACE C18色譜柱上分離一系列藥物活性分析物時(shí)，可以觀(guān)察到2組共洗脫峰。

在ACE C18上的該分離也與其他*的C18柱品牌可以預(yù)期的結(jié)果相同，由于相同（主要是疏水性）的保留機(jī)制，它們顯示選擇性極為相似。
換成典型的PFP相可以導(dǎo)致選擇性發(fā)生變化，但是產(chǎn)生不同的關(guān)鍵對(duì)。
我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)證實(shí)不適合ACE C18和典型PFP相的相同評(píng)估條件可以適用于ACE C18-PFP色譜柱，其能夠?qū)崿F(xiàn)所有17個(gè)組分的分離，包括之前確定的所有關(guān)鍵對(duì)。

應(yīng)用#5 結(jié)構(gòu)不同的分析物

基于與ACE C18相同的超惰性、超高純度硅膠平tai，*的ACE C18-PFP相再次提供了替代選擇性來(lái)使所有13種結(jié)構(gòu)不同的分析物實(shí)現(xiàn)分離，同時(shí)無(wú)需冗長(zhǎng)的方法重開(kāi)發(fā)。

應(yīng)用#6 酸性分析物

與典型的C18相相比，由ACE C18-PFP相提供的額外保留機(jī)制可以產(chǎn)生顯著不同的色譜選擇性，包括峰洗脫順序中的許多逆轉(zhuǎn)。

應(yīng)用#7 - 兒茶酚胺

兒茶酚胺的該分離效果闡明，與通過(guò)具有弱疏水性相互作用的典型PFP所實(shí)現(xiàn)的分離結(jié)果相比，ACE C18-PFP上的強(qiáng)疏水性相互作用可以實(shí)現(xiàn)左旋多巴和腎上腺素的更佳分離。

結(jié)論
當(dāng)分析吡啶（一種高堿性小分子）時(shí)，可以看到柱效、峰形和選擇性的顯著差異。
拖尾和保留增加表明，吡啶和固定相上表面的硅醇基之間存在不受歡迎的次級(jí)相互作用。

這些相互作用也可能導(dǎo)致色譜柱可重現(xiàn)性不佳。
之前已對(duì)ACE C18色譜柱進(jìn)行了獨(dú)立測(cè)試，發(fā)現(xiàn)具有出色的柱效和ji致的惰性。

新型ACE C18-PFP保持了這一優(yōu)異性能。

ACE®固定相幾乎消除了硅醇基對(duì)HPLC分離的不利影響

優(yōu)良的溫度和pH穩(wěn)定性
在低pH值時(shí)，色譜柱退化是由鍵合相的水解所致，同時(shí)觀(guān)察到保留值降低。

鍵合相的性質(zhì)、硅膠表面的純度和鍵合密度都是關(guān)鍵參數(shù)。

使用較低純度的硅膠、較短的配體和較低的鍵合密度都是有助于加速配體斷裂和降低柱壽命的因素。

使用設(shè)計(jì)用于加速色譜柱降解的條件，ACE C18-PFP相顯示保留損失極少，其壽命相當(dāng)于高度穩(wěn)定的ACE C18相，這表明ACE C18-PFP可能適用于PFP色譜柱顯示壽命縮短的應(yīng)用。
正如預(yù)期，基于中等純度硅膠的C18鍵合色譜柱（Zorbax SB-C18——之前被認(rèn)為可以為高溫和低pH應(yīng)用提供優(yōu)異穩(wěn)定性的一種相）和低純度硅膠（Waters Spherisorb ODS2）顯示壽命顯著降低。

有保證的可重現(xiàn)性和*可擴(kuò)展性
與替代選擇性同等重要的是的可重現(xiàn)性。

固定相不同批次之間的變化是客戶(hù)關(guān)注的較常見(jiàn)原因。

ACE固定相通過(guò)保持對(duì)整個(gè)制造過(guò)程的嚴(yán)格控制并建立純度、選擇性、保留值、柱效和不對(duì)稱(chēng)性的嚴(yán)格規(guī)范，幾乎*消除硅醇基對(duì)HPLC分離的不可預(yù)測(cè)的不利影響。

因此，如下圖所示，所有ACE C18-PFP色譜柱均可以保證批次間和柱間的可重現(xiàn)性。

將可用的3μm、5μm和10μm粒徑與從毛細(xì)管到制備規(guī)模的一系列柱尺寸相結(jié)合，可確保方法可重現(xiàn)地放大或縮小。

上述色譜圖顯示，當(dāng)硅膠批次和硅烷批次改變時(shí)可以獲得的可重現(xiàn)性，并當(dāng)粒徑和柱直徑改變時(shí)可以獲得可重現(xiàn)的可擴(kuò)展性。

UV和LC/MS兼容性的低流失
許多相顯示有鍵合相的流失，當(dāng)基線(xiàn)穩(wěn)定性受到影響時(shí)，這可以在梯度條件下被清晰地觀(guān)察到。

盡管大多數(shù)超純C18相可以預(yù)期產(chǎn)生低柱流失，但是需要謹(jǐn)慎選擇替代選擇性的鍵合相，以確保在低UV波長(zhǎng)或LC/MS下進(jìn)行分析時(shí)柱流失不會(huì)引起不可預(yù)見(jiàn)的問(wèn)題。

需要注意的是，色譜柱的流失取決于許多因素，并且可能會(huì)隨時(shí)間和系統(tǒng)而變化。

因此，在比較色譜柱流失時(shí)，必須在受控條件下進(jìn)行。

本實(shí)例對(duì)超純ACE C18色譜柱（頂部）的低流失特性與PFP色譜柱（中間）的高流失特性進(jìn)行了比較。

ACE C18-PFP色譜柱（底部）顯示其流失水平與ACE C18相當(dāng)，盡管后者包含可以提供替代選擇性的完整PFP官能團(tuán)。

UV流失的比較

在相同條件下對(duì)更寬范圍的色譜柱的進(jìn)一步分析證實(shí)，*的高純度C18柱品牌顯示出相似的低水平色譜柱流失。

然而，傳統(tǒng)上*改變選擇性的替代鍵合相（即苯基，極性嵌入式，PFP表面化學(xué)物質(zhì)）的評(píng)估顯示，所有這些非C18色譜柱均有顯著更高的流失。
ACE C18-PFP將低流失水平（典型的*C18色譜柱品牌）與替代選擇性相結(jié)合，從而為分析者提供了有價(jià)值的方法開(kāi)發(fā)工具。

當(dāng)采用MS檢測(cè)時(shí)，非C18相給分析者帶來(lái)了傳統(tǒng)上使用所出現(xiàn)的額外挑戰(zhàn)。

在情況下，柱流失可能會(huì)污染檢測(cè)器信號(hào)并掩蓋重要分析物。
在以下實(shí)例中，在梯度運(yùn)行的8-10分鐘時(shí)段中監(jiān)測(cè)柱流失，此時(shí)有機(jī)物的百分比增加至其大水平，因此柱流失也是zui高的。

MS Spectra（左邊系列）提供了在該8-10分鐘窗口中檢測(cè)到流失的m/z裂解，而總離子色譜圖（右邊系列）闡明了在相同8-10分鐘時(shí)間段內(nèi)所獲得的流失結(jié)果。

通過(guò)LC/MS分析，極性嵌入式色譜柱的TIC追蹤和MS光譜（之前通過(guò)UV檢測(cè)顯示有顯著流失）再次顯示柱流失水平較高。

來(lái)自空白運(yùn)行（在沒(méi)有連接色譜柱的情況下開(kāi)展）的MS光譜可以使背景系統(tǒng)流失量化。

ACE C18-PFP色譜柱和*的C18色譜柱均顯示與空白運(yùn)行相似的流失水平，這表明正在發(fā)生的柱流失可以忽略。

材料特性

a 為了獲得*色譜柱壽命，*使用2-8的pH范圍。為了在高pH值下增加色譜柱壽命，必須考慮有機(jī)緩沖液、低緩沖液濃度、高%有機(jī)溶劑和低溫。

供貨信息：

方法驗(yàn)證工具包
ACE相因具有出色的可重現(xiàn)性而得到了廣泛認(rèn)可。為了幫助進(jìn)行方法驗(yàn)證，我們提供了一個(gè)方便的工具包，其中包含3個(gè)相同鍵合相和尺寸的色譜柱，填充有3個(gè)不同批次的硅膠。
方法驗(yàn)證工具包適用于所有相和色譜柱尺寸，其中較常見(jiàn)的工具包如下所示。

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