Elisa實(shí)驗(yàn)：ELISA檢測需做好那幾點(diǎn)，可得出正確結(jié)果

　　ELISA實(shí)驗(yàn)獲得正確結(jié)果的6大關(guān)鍵要點(diǎn)

　　從樣本處理到最終讀數(shù)全流程嚴(yán)格把控以下環(huán)節(jié)，可從根源上避免假陽性、假陰性、重復(fù)性差等問題，得到穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　　1. 樣本采集與保存規(guī)范

　　絕對(duì)避免嚴(yán)重溶血，血紅蛋白中的血紅素基團(tuán)有類似過氧化物酶活性，會(huì)直接在HRP標(biāo)記的ELISA體系中引發(fā)非特異性顯色，拉高背景值。

　　無菌分離的血清樣本2~8℃可保存1周，有菌操作樣本需立即-20℃凍存，?嚴(yán)禁反復(fù)凍融?，凍融產(chǎn)生的機(jī)械剪切力會(huì)破壞蛋白結(jié)構(gòu)，直接導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

　　渾濁、有絮狀沉淀的樣本，需12000rpm高速離心取上清后再檢測，避免雜質(zhì)造成孔板花板、非特異性吸附。

　　2. 試劑準(zhǔn)備與質(zhì)控

　　所有試劑盒試劑提前從冰箱取出，?室溫平衡20~30分鐘?再使用，避免低溫導(dǎo)致孔內(nèi)升溫過慢，抗原抗體結(jié)合不充分，弱陽性樣本直接漏檢。

　　濃縮洗滌液稀釋必須使用無熱源去離子水，若出現(xiàn)鹽結(jié)晶，37℃水浴溶解混勻后再使用，禁止直接用自來水稀釋引入雜質(zhì)。

　　提前設(shè)置空白孔、梯度標(biāo)準(zhǔn)孔、陰性對(duì)照孔，所有組別做好標(biāo)記，空白孔用于儀器調(diào)零，對(duì)照孔用于快速排查實(shí)驗(yàn)污染與非特異性反應(yīng)。

　　3. 精準(zhǔn)加樣操作

　　加樣時(shí)槍頭垂直懸空，將液體直接加到孔底，避免觸碰孔壁上部非包被區(qū)，防止非特異性吸附;每更換一個(gè)樣本必須更換槍頭，杜絕交叉污染。

　　加樣動(dòng)作輕柔勻速，避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)液體積不均，直接造成孔間OD值偏差過大;濺出的液體要及時(shí)用吸水紙擦除，防止污染相鄰孔。

　　優(yōu)先使用多通道移液器加樣，保證所有孔的加樣速度、體積一致，大幅降低復(fù)孔CV值，提升數(shù)據(jù)重復(fù)性。

　　4. 嚴(yán)格控溫控時(shí)孵育

　　孵育是ELISA成敗最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，常規(guī)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)孵育溫度為?37℃?，加完樣本后將微孔板放入溫箱時(shí)，需預(yù)留足夠的升溫時(shí)間，避免一放入就開始計(jì)時(shí)，導(dǎo)致實(shí)際有效孵育時(shí)間不足。

　　孵育盒底部墊濕潤濾紙，全程用封板膜密封，避免液體蒸發(fā)引發(fā)邊緣效應(yīng)，邊緣孔顯色異常偏高;孵育時(shí)間嚴(yán)格按說明書執(zhí)行，隨意延長會(huì)大幅增加非特異性結(jié)合，縮短則反應(yīng)不充分。

　　針對(duì)一步法雙抗體夾心法，高濃度樣本需提前做梯度稀釋，避免出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，過量抗原會(huì)導(dǎo)致OD值偏低，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

　　5. 規(guī)范洗板操作

　　洗板是降低背景、避免假陽性的核心步驟，每次洗滌需注滿每孔，浸泡30~60秒后再棄液，重復(fù)洗滌3~5次，最后將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上用力拍干，去除殘留未結(jié)合物。

　　洗板時(shí)避免液體溢出孔外，防止相鄰孔交叉污染;手動(dòng)洗板時(shí)每孔加液量保持一致，自動(dòng)洗板機(jī)使用前需校準(zhǔn)針位，避免漏洗、孔間串液。

　　6. 顯色與讀數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化

　　TMB底物工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用、全程避光，當(dāng)高濃度標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯藍(lán)色梯度時(shí)立刻終止反應(yīng)，避免過度顯色導(dǎo)致背景偏高。

　　終止液加入順序和速度與底物保持同步，確保每孔終止反應(yīng)時(shí)間一致;終止后?15分鐘內(nèi)?必須完成讀數(shù)，超過時(shí)間有色產(chǎn)物會(huì)褪色，導(dǎo)致OD值偏低。

　　酶標(biāo)儀采用?雙波長讀數(shù)?：測量波長設(shè)為450nm，參考波長設(shè)為650nm，可有效消除孔底指紋、水漬帶來的背景噪音，大幅提升讀數(shù)準(zhǔn)確性。

　　注：以上科研產(chǎn)品資料供參考!

　　本生BUNSEN一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。