做elisa實(shí)驗(yàn)需要注意哪些問題呢

　　結(jié)合ELISA樣本處理相關(guān)內(nèi)容，注意事項(xiàng)，覆蓋從實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備到結(jié)果判讀的關(guān)鍵細(xì)節(jié)，常見誤差總結(jié)：

　　一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備注意事項(xiàng)

　　耗材與試劑核對(duì)?

　　必須選用?ELISA專用的平底高結(jié)合力聚苯乙烯酶標(biāo)板?，禁用普通細(xì)胞培養(yǎng)板替代。實(shí)驗(yàn)前仔細(xì)核對(duì)試劑盒組分，確認(rèn)所有試劑在保質(zhì)期內(nèi)，酶結(jié)合物、底物等需提前從-20℃取出，在室溫平衡20~30分鐘，避免低溫直接加樣導(dǎo)致反應(yīng)效率下降。

　　樣本預(yù)處理合規(guī)?

　　不同類型樣本需按對(duì)應(yīng)規(guī)范處理，避免溶血、反復(fù)凍融，渾濁樣本必須提前離心過濾去除沉淀，防止非特異性吸附干擾結(jié)果。

　　二、操作環(huán)節(jié)要點(diǎn)

　　加樣規(guī)范?

　　使用校準(zhǔn)過的移液器，更換一次性槍頭避免交叉污染;加樣時(shí)槍頭貼孔壁45°加入液體，不要觸碰孔內(nèi)液面，不同試劑、不同樣本必須更換槍頭，防止樣本間交叉干擾。

　　溫控與孵育?

　　孵育全程用封板膜密封酶標(biāo)板，避免液體蒸發(fā)，保證孵育溫度穩(wěn)定在?37℃±0.5℃?，溫度波動(dòng)過大會(huì)直接影響抗原抗體結(jié)合效率，導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性差。

　　洗板操作?

　　每孔洗滌液必須注滿，靜置30秒后甩干，重復(fù)3~5次，手動(dòng)洗板后在干凈吸水紙上拍干，避免孔內(nèi)殘留液體;自動(dòng)洗板機(jī)要定期校準(zhǔn)壓力，防止洗板不充分導(dǎo)致背景偏高。

　　顯色與讀數(shù)?

　　TMB底物需現(xiàn)配現(xiàn)用，避光顯色10~30分鐘，所有孔的顯色時(shí)長必須一致;加入終止液后，?30分鐘內(nèi)完成450nm波長的OD值讀取?，避免放置過久數(shù)值漂移。

　　三、結(jié)果保障

　　每次實(shí)驗(yàn)必須同步設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度范圍覆蓋待測樣本的預(yù)期值，每個(gè)樣本設(shè)置2~3個(gè)復(fù)孔，剔除偏差過大的異常值。

　　實(shí)驗(yàn)全程設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系有效性，若出現(xiàn)高背景、無顯色等異常，優(yōu)先排查洗滌次數(shù)、抗體濃度、試劑是否失活這三類常見問題。

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