病毒濃縮 | Amicon® Ultra超濾管應(yīng)用方案

時間：2024/1/4

2023

基因治療

基因治療是通過將特定的細(xì)胞功能改變的遺傳物質(zhì)引入患者來治療遺傳疾病。根據(jù)給藥的方式可以分為：體內(nèi)基因治療（invivo）和體外基因治療（invitro）。

體內(nèi)基因治療指將攜帶治療性轉(zhuǎn)基因的載體直接注入患者體內(nèi)。
體外基因治療包括從患者的細(xì)胞或異體來源提取細(xì)胞，通過攜帶治療性轉(zhuǎn)基因的載體進(jìn)行基因修飾，再將該工程細(xì)胞重新導(dǎo)入患者體內(nèi)。

基因治療的關(guān)鍵步驟是如何有效地通過遞送載體將基因傳遞到目標(biāo)組織/細(xì)胞。根據(jù)載體的屬性分為：病毒類遞送載體和非病毒類遞送載體。不同細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染效率差異很大。因此，已經(jīng)開發(fā)了多種病毒來源的載體系統(tǒng)，用于改善哺乳動物細(xì)胞中的cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)、表達(dá)和篩選。這些系統(tǒng)包括COS細(xì)胞中的猿病毒40復(fù)制子(SV40)以及源自逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒、甲病毒、人類免疫缺陷病毒、牛痘病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒（AAV）的cDNA克隆和表達(dá)載體。以逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒(Ads)或腺相關(guān)病毒(AAVs)的使用最為廣泛。

在臨床試驗中使用病毒載體相關(guān)的挑戰(zhàn)包括生產(chǎn)足夠數(shù)量的臨床級材料和維持病毒載體的生物安全性。病毒載體的生產(chǎn)和純化在方法和病毒產(chǎn)量和質(zhì)量方面各不相同。病毒載體的生成和純化是勞動密集型的且昂貴的，并且可能需要特殊設(shè)備（如超速離心機(jī)）。純化腺病毒、慢病毒和AAV的標(biāo)準(zhǔn)方法是使用密度梯度超速離心，然后進(jìn)行長時間透析。近年來柱或膜層析已成為腺病毒純化的方法。病毒的產(chǎn)量通常通過空斑試驗、TCID50測定和ELISA來確定。對于大多數(shù)應(yīng)用，重組病毒必須純化至高滴度。為了獲得高滴度原液，通常需要濃縮純化的病毒顆粒。

之前我們有文章介紹了使用默克Amicon^®Ultra超濾管分離提取外泌體，今天給大家介紹超濾管的其它應(yīng)用-濃縮病毒！下面介紹使用Amicon^®Ultra離心超濾裝置濃縮三種常見的病毒類型：慢病毒，腺病毒和腺相關(guān)病毒（AAV）。

實驗步驟

包裝細(xì)胞

宿主細(xì)胞鋪板以達(dá)到80-85%的匯合度。

轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)?；蚋腥净畈《绢w粒。

收獲病毒

根據(jù)病毒的不同，使用細(xì)胞上清液或沉淀細(xì)胞或兩者兼而有之來純化重組病毒粒子。通常應(yīng)用三到四輪凍融循環(huán)從細(xì)胞中釋放病毒。然后通過離心或預(yù)過濾將細(xì)胞碎片與細(xì)胞裂解物分離。

病毒純化

通過密度梯度超速離心或柱/膜層析從細(xì)胞裂解物中純化病毒。在某些情況下可以使用肝素或粘蛋白瓊脂糖的親和色譜。然后將純化的病毒溶液通過透析或滲濾完成將緩沖液置換成適當(dāng)?shù)膬Υ嫒芤骸?/span>

病毒濃縮

為了獲得高滴度的病毒原液，可以使用離心超濾濃縮純化的病毒。

備注：正確選擇設(shè)備、膜材料、MWCO、離心速度、離心時間和緩沖液組成對于感染性病毒顆粒的高回收率至關(guān)重要。

Amicon^®Ultra超濾管采用50KDa NMWL Ultracel^® 再生纖維素膜，已被證明可以成功濃縮腺病毒和AAV溶液。對于慢病毒濃度，可以使用50KDa和100kDa膜的超濾管。

實驗結(jié)果

下表顯示了粗制細(xì)胞裂解物和色譜純化的病毒中腺病毒、慢病毒和AAV濃度的典型結(jié)果。

表1：采用Millipore^®超濾產(chǎn)品濃縮病毒

特別注意

①我們不建議將病毒濃縮到超過10¹³顆粒/mL的濃度，以避免可能出現(xiàn)的病毒聚集。

②大多數(shù)病毒不能有效地濃縮并儲存在低鹽緩沖液中。病毒在濃度為<250mM鹽濃度的溶液中離心將導(dǎo)致病毒聚集和傳染性降低。推薦儲存溶液配方是：20mMTris、pH8.0、250mMNaCl、5%山梨糖醇和0.001%PF68（多聚糖酸）。

濃縮的病毒原液也可以通過0.22μm過濾器進(jìn)行過濾滅菌。例如，無菌Steriflip-GP^®過濾裝置（目錄號SCGP00525）可用于50mL或以下的體積或Ultrafree^®MCGV（目錄號UFC30GV0S）可用于體積<0.5mL的樣品。對于較大體積的樣品，則可使用70%消毒處理過的Amicon^®Ultra或Centricon^®Plus70超濾管濃縮。

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