mRNA生物制品質(zhì)量控制家族成員全新亮相

時間：2023/10/8

mRNA藥物是通過將編碼抗原蛋白的mRNA接種到人體，利用人體細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)進(jìn)行表達(dá)合成抗原蛋白，通過抗原蛋白誘導(dǎo)和激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。

由于其具有較低的感染和突變風(fēng)險，能夠同時誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，免疫效能好，研發(fā)和生產(chǎn)周期短，容易實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)等特點(diǎn)，目前被廣泛用于傳染性疾病、腫瘤及罕見病藥物的研發(fā)。

通過酶促體外轉(zhuǎn)錄法制備大量mRNA的工藝已經(jīng)成熟，其中規(guī)?；a(chǎn)過程中主要涉及的工具酶有T7 RNA Polymerase、DNase Ⅰ、RNase Inhibitor、無機(jī)焦磷酸酶等，這些酶的靈活使用極大的方便了生產(chǎn)流程，加速科學(xué)家們研究進(jìn)展。

mRNA規(guī)?；a(chǎn)中的工具酶

T7 RNA Polymerase

T7 RNA聚合酶是由T7噬菌體DNA編碼的，一種DNA依賴性的RNA聚合酶，具有高度啟動子專一性，可催化以T7啟動子序列為起點(diǎn) 5’→ 3’方向的RNA合成，在mRNA藥物研發(fā)中常以其催化目的基因的體外合成，轉(zhuǎn)錄效率和產(chǎn)量高，市面上由其催化的1μg DNA模板可轉(zhuǎn)錄出150-200μg的RNA。

DNase I

脫氧核糖核酸酶I，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶，可以用于各種RNA樣品的處理，消化由T7 RNA聚合酶催化的體外轉(zhuǎn)錄后的DNA模板，65℃加熱10分鐘可使DNaseI失活。

RNase Inhibitor

RNase（Ribonuclease，核糖核酸酶）是一類能夠催化RNA降解為小分子RNA的核酸酶，廣泛存在于真核、原核生物的所有細(xì)胞和組織中，通常有強(qiáng)活性，RNA樣本中微量的RNase污染足以導(dǎo)致其降解。為了減少RNA的損失，適當(dāng)添加RNase抑制劑（RNase inhibitor）是有必要的。

RNase抑制劑是人的胎盤中存在的一種特異性核糖核酸酶(RNase)抑制劑，能夠特異地與RNase以非共價鍵結(jié)合形成復(fù)合體從而使RNase失活。

無機(jī)焦磷酸酶

多種代謝反應(yīng)會產(chǎn)生無機(jī)焦磷酸，Pyrophosphatas無機(jī)焦磷酸酶（PPase）可水解無機(jī)焦磷酸鹽，可以避免無機(jī)焦磷酸對反應(yīng)的抑制，并且提供熱力學(xué)動力促使反應(yīng)向正向進(jìn)行，從而常用于RNA體外轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和擴(kuò)增如HDA或LAMP等溫擴(kuò)增等。

尤其在工業(yè)化生產(chǎn)mRNA疫苗的時候會產(chǎn)生大量的無機(jī)焦磷酸鹽，為了保證mRNA疫苗高效生產(chǎn)，可以添加無機(jī)焦磷酸酶，解除生成的無機(jī)焦磷酸鹽對反應(yīng)體系的抑制。

dsRNA

添加相關(guān)工具酶還會帶來其他影響，例如使用 T7 RNA 聚合酶合成RNA的技術(shù)目前已經(jīng)很成熟，但之前的研究已經(jīng)確定了體外合成過程中某些副產(chǎn)物的存在，這些副產(chǎn)物會觸發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，包括雙鏈 RNA (dsRNA)，這已被證明成為免疫通路的主要觸發(fā)。

檢測mRNA生物制品中殘留的必要

大多數(shù)工具酶的使用能幫助我們獲得大量的RNA，但工具酶本身對于藥物成品來說亦是一種雜質(zhì)，這些雜質(zhì)與mRNA一起通過LNP包封進(jìn)入細(xì)胞釋放后，極有可能產(chǎn)生高強(qiáng)度的免疫原性從而連帶引發(fā)mRNA的降解。以及產(chǎn)生的雙鏈RNA (dsRNA)雜質(zhì)具有潛在的免疫原性，對患者有害。因此，mRNA相關(guān)制品需要測定和控制工具酶和dsRNA的含量。

相關(guān)法規(guī)要求與檢測方法

——mRNA類的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可以納入外觀、pH值、含量、鑒別、序列分析、mRNA完整性、加帽率、poly（ A）長度及分布、生物學(xué)活性、無菌檢測、細(xì)菌內(nèi)毒素、雙鏈 RNA殘留、溶劑殘留等檢測項(xiàng)目。

體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價技術(shù)知道原則（試行）

--2022年05月

——mRNA等通過體外轉(zhuǎn)錄方式制備的核酸產(chǎn)品，可通過對原材料、轉(zhuǎn)錄模板和轉(zhuǎn)錄條件的研究，控制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的質(zhì)量。轉(zhuǎn)錄用的重要原材料，如核苷酸、修飾核苷酸、 5’-帽或類似物、工具酶（如轉(zhuǎn)錄酶等）等應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制，可關(guān)注其純度和雜質(zhì)，轉(zhuǎn)錄酶還需關(guān)注其保真度等。

轉(zhuǎn)錄模板的制備應(yīng)能確保模板的序列準(zhǔn)確性和純度，減少雜質(zhì)殘留。體外轉(zhuǎn)錄條件應(yīng)經(jīng)過充分的研究，提高轉(zhuǎn)錄序列的準(zhǔn)確性、均一性和完整性，減少副反應(yīng)產(chǎn)物，如不完整 RNA、雙鏈RNA、截短RNA、長鏈RNA等的形成。

體內(nèi)基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）

--2022年05月

CDE發(fā)布的指導(dǎo)原則《病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》以及美國藥典（USP）發(fā)布的《mRNA疫苗質(zhì)量分析方法》的指南草案中（見下圖）指出:需要對整個工藝進(jìn)行質(zhì)量控制，保證質(zhì)量有效、安全可控。

其指導(dǎo)原則中還規(guī)定，需要對其生產(chǎn)工藝相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行檢測，對主要雜質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測與分析，需要更*的評估方法來確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。其中對T7 RNA和dsRNA的殘留進(jìn)行了明確規(guī)定。

疫苗行業(yè)

美國藥典(USP)發(fā)布的《mRNA疫苗質(zhì)量分析方法》指南草案

由于mRNA技術(shù)的應(yīng)用相對較新，在藥物研發(fā)和制造過程中指導(dǎo)mRNA質(zhì)量研究與控制方面的監(jiān)管指南和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)仍在不斷發(fā)展。

BlueKit產(chǎn)品信息

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mRNA生物制品質(zhì)量控制家族成員全新亮相

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