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提高昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)率，它是之選
本研究中，筆者測試了作為一種全新技術(shù)的Sartoclear Dynamics® Lab V500，用于在Sf9細(xì)胞表達(dá)重組蛋白純化前，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行快速澄清的效果。蛋白表達(dá)載體帶有一段信號(hào)編碼序列，從而確保表達(dá)后的蛋白能夠分泌到細(xì)胞外。因此，純化蛋白質(zhì)之前必須去除培養(yǎng)基中的細(xì)胞，但是使用傳統(tǒng)方法操作（過濾后進(jìn)行離心操作）十分費(fèi)時(shí)。本文中，筆者通過與傳統(tǒng)方法進(jìn)行對(duì)比，展示了Sartoclear Dynamics® Lab 過濾器的*性能。它不僅不會(huì)影響蛋白產(chǎn)量，還能節(jié)省大量時(shí)間；對(duì)于任何致力于提高昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)率和通量的實(shí)驗(yàn)室來說，它必將是之選。
引言
了解蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是理解其功能的關(guān)鍵。對(duì)于疾病中所涉及的蛋白質(zhì)，三維結(jié)構(gòu)信息將有助于設(shè)計(jì)出針對(duì)靶向目標(biāo)的、具有高度特異性的新型藥物。
純化蛋白對(duì)于測定結(jié)構(gòu)十分重要。如今，使用不同的蛋白表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成為眾多實(shí)驗(yàn)室的慣例做法。表達(dá)系統(tǒng)的選擇通常取決于物種、蛋白的修飾程度和目標(biāo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。在表達(dá)載體中使用信號(hào)序列，可在細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌出純度相對(duì)較高的表達(dá)蛋白質(zhì)，且無需使用昂貴的細(xì)胞破碎設(shè)備，還能夠很大程度地縮短優(yōu)化純化方法[1]所需的時(shí)間。然而，該方法存在重大缺點(diǎn)，即在純化之前需要耗費(fèi)大量時(shí)間才能澄清大量的細(xì)胞培養(yǎng)液。此外，所使用的離心機(jī)處理量有限，這還會(huì)增加澄清培養(yǎng)基所需的時(shí)間，因?yàn)樗仨毝啻芜\(yùn)行才能達(dá)到我們的需要。筆者還注意到，在過濾昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，即使已經(jīng)通過離心去除了細(xì)胞，流速仍舊很慢。這可能與存在亞微米粒子有關(guān)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液離心操作后，它仍懸浮于其中，從而導(dǎo)致堵塞過濾膜[2]。
當(dāng)初開發(fā)Sartoclear Dynamics®系列過濾產(chǎn)品是為了大大減少從培養(yǎng)液中過濾哺乳動(dòng)物細(xì)胞所需的時(shí)間。通過向培養(yǎng)液中添加硅藻土，可促進(jìn)多孔濾餅成型，進(jìn)而防止過濾器堵塞，并快速獲得樣品中的細(xì)胞培養(yǎng)上清液（圖1）。由于無需離心操作步驟，因此可避免由于離心容量和可用性所導(dǎo)致的問題。對(duì)于筆者的研究而言，昆蟲細(xì)胞能夠表達(dá)并分泌目標(biāo)蛋白，必須對(duì)培養(yǎng)上清液進(jìn)行純化。因此，筆者測試了Sartoclear Dynamics®用于澄清昆蟲細(xì)胞（包含目標(biāo)蛋白）培養(yǎng)上清液的效果，并將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了對(duì)比。
圖1：使用傳統(tǒng)方法和Sartoclear Dynamics® Lab 主體加料過濾方法澄清細(xì)胞培養(yǎng)液的原理
材料和方法
采用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目標(biāo)蛋白。根據(jù)制造商的說明，在Sf-900™ II SFM (Thermo Fisher Scientific, 10902088) 中培養(yǎng) Sf9 細(xì)胞 (Thermo Fisher Scientific, 11496015 ) 。使用帶有目標(biāo)蛋白編碼基因的桿狀病毒感染1.5L的懸浮培養(yǎng)液，并在27°C溫度下以240 rpm的轉(zhuǎn)速震蕩孵化90個(gè)小時(shí)。
收獲培養(yǎng)液并分成三個(gè)470 mL等量樣本，用于澄清和蛋白質(zhì)純化。份等量樣本使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行澄清。將細(xì)胞5,000g離心15分鐘后，將上層清液通過 0.22 μm的PES過濾器。然后，使用Sartoclear Dynamics®系統(tǒng)澄清第二和第三份樣本。添加5或10g硅藻土，并將溶液混合成均勻的懸浮液，然后使用0.22μm的PES過濾器對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行過濾。
使用金屬鰲合親和層析（IMAC）方法純化細(xì)胞培養(yǎng)基中每個(gè)澄清樣本的蛋白質(zhì)。將培養(yǎng)基串聯(lián)加載至 5 × 1 mL HisTrap層析柱中（通用生命科學(xué)部，17-3712-05），并使用HTE緩沖液（50mm HEPES、500mm NaCL、pH 7.4）進(jìn)行預(yù)平衡。使用100 mL HTE緩沖液和75 mL（包含25mm咪唑）的HTE緩沖液清洗層析柱，以去除雜質(zhì)，并使用25 mL（包含500mm咪唑）的HTE緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白。
結(jié)果與討論
通過收獲細(xì)胞培養(yǎng)液發(fā)現(xiàn)：每毫升總細(xì)胞密度的測量值達(dá)1.5 × 106。
記錄澄清每種細(xì)胞培養(yǎng)液樣品所花的時(shí)間（圖2）。將記錄時(shí)間分為制備時(shí)間（即測量培養(yǎng)液容量和平衡離心管或添加分別用于標(biāo)準(zhǔn)方法或Sartoclear Dynamics® 方法的硅藻土）、離心時(shí)間（于標(biāo)準(zhǔn)方法）和過濾時(shí)間（兩種方法）。
圖2：根據(jù)處理時(shí)間比較澄清方法。Sartoclear Dynamics® Lab 大大降低了澄清細(xì)胞培養(yǎng)基所需的時(shí)間。
使用標(biāo)準(zhǔn)離心過濾方法制備澄清細(xì)胞培養(yǎng)基，大約需要34分鐘。盡管相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)方法，使用含5g硅藻土過濾優(yōu)化的Sartoclear Dynamics® 并未減少過濾時(shí)間，但是略去離心步驟意味著至少可減少53%的總制備時(shí)間。將硅藻土數(shù)量增加至10g，總制備時(shí)間可減少6分鐘，至少可節(jié)省 82 %的時(shí)間。
就通量而言，標(biāo)準(zhǔn)方法及使用5g和10g硅藻土過濾優(yōu)化的方法的過濾時(shí)間分別等同于2.35、2.35 和 14.1 L/h的流速。使用5g硅藻土制備樣品過程中，過濾期間可觀察到硅藻土和細(xì)胞出現(xiàn)部分沉降現(xiàn)象。可能硅藻土早期沉降導(dǎo)致了流速一定程度上的降低。顯然，絕大多數(shù)硅藻土/細(xì)胞混合物可通過輕輕搖晃過濾裝置即可重新懸浮，使流速回到正常水平；但過濾更高細(xì)胞密度培養(yǎng)液時(shí)，使用10g硅藻土的規(guī)格，應(yīng)該更為合適。
為了測試Sartoclear Dynamics®對(duì)蛋白產(chǎn)量的影響，應(yīng)采用IMAC方法純化每個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)，并比較洗脫峰的大?。▓D3）。與使用標(biāo)準(zhǔn)方法制備樣品所出現(xiàn)的洗脫峰相比，利用含10g硅藻土過濾優(yōu)化的Sartoclear Dynamics®系統(tǒng)制備樣品可產(chǎn)生具有更高吸光度的洗脫峰，其表明存在更多的蛋白質(zhì)。但是相比而言，標(biāo)準(zhǔn)方法所產(chǎn)生的洗脫峰較寬（即容量較高），因此使用硅藻土混合樣品基本上不會(huì)影響蛋白產(chǎn)量。
圖3：使用標(biāo)準(zhǔn)離心過濾方法和經(jīng)10g硅藻土優(yōu)化的Sartoclear Dynamics® Lab過濾系統(tǒng)制備樣品，比較兩者之間的蛋白質(zhì)洗脫峰 (★)。
結(jié)論
Sartoclear Dynamics® Lab可加快細(xì)胞培養(yǎng)基的澄清過程。使用該過濾系統(tǒng)將無需采取離心操作，節(jié)省大量時(shí)間，并顯著提高生產(chǎn)力和通量。使用硅藻土混合樣品后，并未對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量產(chǎn)生負(fù)面影響。
該系統(tǒng)有多種型號(hào)可選，可用于澄清15mL至1L批量的細(xì)胞培養(yǎng)基，能夠滿足用戶的眾多需求。
