在過(guò)去十年中，單細(xì)胞基因、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組學(xué)改變了科學(xué)家理解細(xì)胞異質(zhì)性的方式。而細(xì)胞命運(yùn)、疾病進(jìn)展以及微環(huán)境適應(yīng)能力，往往直接體現(xiàn)在代謝物(含脂質(zhì)，下同)的動(dòng)態(tài)變化之中。代謝物不僅是生物化學(xué)反應(yīng)的終端產(chǎn)物，更是生化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。然而，小分子在單細(xì)胞尺度上的檢測(cè)面臨豐度低、易擴(kuò)散、動(dòng)態(tài)范圍廣、結(jié)構(gòu)多樣性高等更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。在單細(xì)胞尺度上捕獲這些小分子信息一直被認(rèn)為是單細(xì)胞技術(shù)面臨的“最后一公里” 。
Thermo Scientific™ Orbitrap™ 超高分辨質(zhì)譜平臺(tái)憑借 “超高分辨率、超高質(zhì)量精度和靈敏度，靈活的正負(fù)極性切換掃描能力” ，結(jié)合多種進(jìn)樣與采集策略，正在推動(dòng)單細(xì)胞代謝與脂質(zhì)組學(xué)從概念驗(yàn)證走向?qū)嵺`應(yīng)用。從直接進(jìn)樣實(shí)現(xiàn)極簡(jiǎn)路徑的小分子檢測(cè)，到 納升液相實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)深度覆蓋，單細(xì)胞代謝組學(xué)(Single-cell metabolomics, SCM)正在形成更加完整的技術(shù)版圖。
01 單細(xì)胞采樣+nanoESI-MS實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞代謝組學(xué)分析
單細(xì)胞代謝組學(xué)的主流手段之一是通過(guò)對(duì)單細(xì)胞分選或采樣后，直接引入質(zhì)譜檢測(cè)，通常使用納升甚至皮升級(jí)電噴霧以提高單細(xì)胞檢測(cè)的靈敏度。近年來(lái)，清華大學(xué)張新榮研究團(tuán)隊(duì)在Orbitrap 質(zhì)譜平臺(tái)開(kāi)發(fā)出了多種單細(xì)胞代謝組學(xué)分析裝置，包括通過(guò)可直接插入活細(xì)胞捕獲代謝物的探針電噴霧電離技術(shù)(Probe-ESI-MS)[1]、 可以延時(shí)噴霧以采集二級(jí)質(zhì)譜的pulsed-dc-ESI-MS技術(shù)[2]、液滴萃取和皮升電噴霧技術(shù)[3]、微孔納升液滴微萃取技術(shù)[4]等，使得超過(guò)600種代謝物和300種磷脂分子得以在單細(xì)胞水平鑒定(圖1)。為了應(yīng)對(duì)單細(xì)胞分析中基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重和皮升電噴霧穩(wěn)定性的問(wèn)題，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)黃光明研究團(tuán)隊(duì)使用誘導(dǎo)電噴霧電離質(zhì)譜(Induced ESI, InESI)技術(shù)與膜片鉗相結(jié)合，在單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞中鑒定出新型神經(jīng)遞質(zhì)尿嘧啶酸，揭示了其在運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)相關(guān)神經(jīng)環(huán)路中的重要作用 [5]。
圖1. nanoESI單細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)手段
(點(diǎn)擊查看大圖)
目前，基于單細(xì)胞原位顯微采樣，皮升電噴霧的單細(xì)胞代謝組學(xué)方案在Orbitrap Exploris™ 240 平臺(tái)得以實(shí)現(xiàn)[6](圖2)。通過(guò)和華儀寧創(chuàng)智能科技有限公司SinCell-100全自動(dòng)單細(xì)胞代謝物分析儀的強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，我們對(duì)人胃腺癌細(xì)胞(AGS)、未分化胃癌細(xì)胞(HGC)、人胃黏膜上皮細(xì)胞(GSE)進(jìn)行了單細(xì)胞水平的非靶向代謝組學(xué)分析，鑒定出近300種內(nèi)源性代謝物，其中94種和85種代謝物在AGS和GSE組，HGC和GSE組顯著變化(圖3)。值得注意的是，單細(xì)胞分析具有 “不可重復(fù)進(jìn)樣” 的特性，一個(gè)細(xì)胞只能檢測(cè)一次，無(wú)法兩次分析獲得正負(fù)離子數(shù)據(jù)。而Orbitrap Exploris™ 240采用先進(jìn)的極性切換模式，一次分析即可同時(shí)獲得正離子和負(fù)離子模式下的代謝物，結(jié)合數(shù)據(jù)非依賴掃描(DIA)得到代謝物的二級(jí)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞代謝組的深度覆蓋和準(zhǔn)確鑒定。
圖2. SinCell-100-Orbitrap Exploris 240單細(xì)胞代謝組學(xué)檢測(cè)平臺(tái)和工作流
圖3. 胃癌細(xì)胞差異分析。A：人胃腺癌細(xì)胞(AGS) vs 人胃黏膜上皮細(xì)胞(GSE)；B：未分化胃癌細(xì)胞(HGC) vs人胃黏膜上皮細(xì)胞(GSE)
02 單細(xì)胞采樣-納升LC-MS實(shí)現(xiàn)高覆蓋單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)分析
直接進(jìn)樣的單細(xì)胞分析方法常常受到代謝物和脂質(zhì)共流出導(dǎo)致的離子抑制、異構(gòu)體難分離以及重現(xiàn)性不足等問(wèn)題的限制。色譜分離是提升數(shù)據(jù)質(zhì)量的關(guān)鍵，但由于單細(xì)胞樣本中代謝物含量極低，常規(guī)流速 LC-MS 往往難以獲得理想的檢測(cè)深度。納升液相技術(shù)通過(guò)大幅降低流速，顯著提升 ESI 離子化效率，相比常規(guī)流速可提升約 10–100 倍的檢測(cè)靈敏度，目前已成功應(yīng)用于單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)分析中。Thermo Scientific™ Vanquish Neo™ UHPLC 搭配 EASY-Spray™ PepMap™(75 μm × 15 cm)集成式納升色譜柱與 nanoESI 源，顯著提升單細(xì)胞脂質(zhì)分析的靈敏度與穩(wěn)健性(圖4)。在該平臺(tái)下，單細(xì)胞樣本中超過(guò)500+ 脂質(zhì)分子在MS/MS水平得以準(zhǔn)確鑒定[7,8](圖5)。(相關(guān)信息請(qǐng)參閱：Orbitrap Exploris 240“力挑”單細(xì)胞脂質(zhì)分析難題——揭秘輻射對(duì)癌細(xì)胞的隱藏影響)
圖4. 單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)解決方案
圖5. 單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)正負(fù)切換性能和PANC-1 Cell鑒定深度(點(diǎn)擊查看大圖)
03 流式質(zhì)譜助力單細(xì)胞代謝組學(xué)邁入高通量時(shí)代
將流式細(xì)胞技術(shù)與質(zhì)譜相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)在線單細(xì)胞分選分析。2019年，清華大學(xué)張新榮研究團(tuán)隊(duì)提出了免標(biāo)記的CyESI-MS技術(shù)[9]：使用鞘流液在線萃取位于毛細(xì)管內(nèi)的細(xì)胞懸液，直接進(jìn)入Orbitrap MS實(shí)現(xiàn)非標(biāo)記單細(xì)胞代謝組學(xué)分析。通過(guò)細(xì)胞濃度控制、流式分選和“脈沖信號(hào)”識(shí)別處理單細(xì)胞事件，配合Q-Exactive Orbitrap 質(zhì)譜最高實(shí)現(xiàn)38 cells/min的高通量檢測(cè)，鑒定深度可達(dá)200~300個(gè)代謝物(正負(fù)模式)。2026年，來(lái)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)院和中國(guó)計(jì)量大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種高通量無(wú)標(biāo)記活細(xì)胞質(zhì)譜方法(high-throughput and label-free viability informed single-cell mass spectrometry , ViSCMS),可以同時(shí)測(cè)定細(xì)胞代謝譜和存活狀態(tài)，并成功應(yīng)用于結(jié)直腸癌亞型分類[10] (圖6)。北京大學(xué)白玉教授研究團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞層面的含時(shí)動(dòng)態(tài)代謝流分析技術(shù)(圖7)。他們以MDA-MB-231細(xì)胞為模型，分別用[U-¹³C]-葡萄糖和[U-¹³C]-谷氨酰胺標(biāo)記培養(yǎng)，最終發(fā)現(xiàn)包括天冬氨酸代謝、Krebs循環(huán)、嘌呤代謝等多條代謝通路被標(biāo)記；并利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在氧化磷酸化、Krebs循環(huán)等通路活性發(fā)生顯著升高 [11]。
圖6. 基于流式細(xì)胞質(zhì)譜的單細(xì)胞分析平臺(tái)
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圖7. 動(dòng)態(tài)單細(xì)胞分析平臺(tái)
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04 質(zhì)譜成像，從空間到單細(xì)胞代謝組學(xué)
在組織層面上進(jìn)行單細(xì)胞研究更有助于了解細(xì)胞在微環(huán)境中的異質(zhì)性。上述單細(xì)胞分析方法無(wú)法同時(shí)獲得細(xì)胞的空間信息，單細(xì)胞尺度的質(zhì)譜成像(Mass Imaging, MSI)技術(shù)是解決上述問(wèn)題的最佳利器之一。2025年歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室Theodore Alexandrov團(tuán)隊(duì)在Cell雜志上開(kāi)發(fā)了開(kāi)發(fā)了HT SpaceM技術(shù)，結(jié)合AP-SMALDI5 AF & Q-Exactive Plus Orbitrap質(zhì)譜成像技術(shù)，為單細(xì)胞小分子代謝物分析提供了革命性工具(圖8)。該技術(shù)不僅克服了傳統(tǒng)MSI中只能看清磷脂分子的局限性，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定檢測(cè)氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸等代謝物；還開(kāi)發(fā)了將MSI和顯微成像幾何配準(zhǔn)，通過(guò)反卷積算法將像素點(diǎn)還原為單細(xì)胞信息 [12]。(詳細(xì)信息請(qǐng)參閱：AP-SMALDI Orbitrap質(zhì)譜成像系統(tǒng)助力打造革命性單細(xì)胞代謝組學(xué)平臺(tái))
圖8. 質(zhì)譜成像單細(xì)胞代謝組學(xué)HT SpaceM 技術(shù)
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結(jié)語(yǔ)
單細(xì)胞代謝組學(xué)的發(fā)展，正在從“測(cè)得更多”邁向“理解更深”。當(dāng)代謝與脂質(zhì)層面的信息被納入單細(xì)胞解析框架，我們開(kāi)始架起連接基因調(diào)控、蛋白表達(dá)與細(xì)胞功能表型之間的重要橋梁；我們開(kāi)始能夠回答更多關(guān)于細(xì)胞異質(zhì)性、代謝重編程與功能狀態(tài)轉(zhuǎn)換的問(wèn)題…
賽默飛在單細(xì)胞代謝組學(xué)方案展現(xiàn)了不同技術(shù)體系之間的協(xié)同性，Vanquish Neo nanoUHPLC 提供的脂質(zhì)深度覆蓋；高分辨、高質(zhì)量精度、快速正負(fù)離子極性切換 Orbitrap 平臺(tái)帶來(lái)的數(shù)據(jù)完整性、鑒定準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性保障，共同構(gòu)成了單細(xì)胞代謝和脂質(zhì)組學(xué)各種創(chuàng)新平臺(tái)的“新基建”。在單細(xì)胞時(shí)代的下一個(gè)十年，我們期待與更多科研同行一起，在單細(xì)胞分子層面拓寬新的研究邊界。
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