引 言
生牛乳中富含多種天然活性蛋白，如 α-乳白蛋白 (α-Lactalbumin)、β-乳球蛋白 (β-Lactoglobulin)、乳鐵蛋白(Lactoferrin, LF)、免疫球蛋白 G (Immunoglobulin G, IgG) 和乳過氧化物酶 (Lactoperoxidase, LP) 等，這些天然活性蛋白在抵抗細菌、病毒入侵，增強免疫力，促進組織修復和生長發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用。其中 α-乳白蛋白具有抗癌、抗菌和抗病毒作用，調節(jié)免疫功能，促進乳糖合成和乳分泌；β-乳球蛋白具有降膽固醇、抗氧化和抗病毒活性，促進脂溶性維生素的消化吸收。不同的熱處理方式(巴氏殺菌、超高溫 (UHT) 滅菌、蒸發(fā)濃縮及噴霧干燥等)，會導致乳制品中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白出現(xiàn)不同程度的變性失活，從而影響其營養(yǎng)價值及市場售價。
賽默飛新行標應對方案亮點
1.本試驗參考 NY/T 4630-2025 以及相關團體標準和企業(yè)標準，對巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳和嬰幼兒配方奶粉中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的含量進行測定。NY/T 4630-2025 將于 2025 年 5 月 1 日正式實施。
2.本試驗采用 2.6 μm 粒徑的實心核顆粒 Accucore 150 C4 色譜柱，配合更低的流速 (0.8 mL/min)、更小的進樣體積 (10 μL) 和 更高的采樣頻率 (10 Hz)，使得 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的峰形及分離度均由于標準。
3.為獲得良好的峰形和分離度，試驗對樣品前處理和液相色譜條件進行了適當優(yōu)化，在柱溫 60 ℃、流速 0.8 mL/min 條件下，以 0.1% 三氟乙酸水-0.1% 三氟乙酸乙腈 作為流動相進行梯度洗脫，系統(tǒng)最大壓力值不超過 110 bar。
4.試驗結果表明：α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白色譜峰形良好，柱效優(yōu)異，分離度卓越，其中 α-乳白蛋白主峰與附近干擾峰的分離度顯著優(yōu)于標準譜圖。α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標準品溶液 (100 μg/mL)，α-乳白蛋白保留時間為 21.900 min，不對稱因子 0.98，理論塔板數(shù) 321137；β-乳球蛋白 B 保留時間為 24.747 min，不對稱因子 1.01，理論塔板數(shù) 352451；β-乳球蛋白 A 保留時間為 25.467 min，不對稱因子 1.00，理論塔板數(shù) 373359；α-乳白蛋白與 β-乳球蛋白 B 分離度為 17.77，β-乳球蛋白 B 與 β-乳球蛋白 A 分離度為 4.33；連續(xù)四次進樣，保留時間和峰面積的 RSD 均小于 0.3%，方法重現(xiàn)性好；α-乳白蛋白標準品溶液線性范圍 0.00-200 μg/mL，線性相關系數(shù) r2≥0.9997，β-乳球蛋白標準品溶液線性范圍 0.00-200 μg/mL，線性相關系數(shù) r2≥0.9991，線性良好。
5.在反相液相色譜法測定乳制品中 α-乳白蛋白與 β-乳球蛋白含量的試驗中，Accucore 150 C4 色譜柱配合 Vanquish Core 高效液相色譜系統(tǒng)，表現(xiàn)出了良好的重現(xiàn)性和優(yōu)異的穩(wěn)定性，方法檢出限和定量限均滿足標準要求，可供乳制品企業(yè)及食品檢測實驗室參考。
6.參考相關文獻，在凝膠滲透色譜法測定乳制品中 α-乳白蛋白與 β-乳球蛋白含量的試驗中，串聯(lián)使用兩支 MAbPac SEC-1 (300 Å, 5 μm, 7.8×300 mm)體積排阻色譜柱，以 6 M 鹽酸胍為流動相進行等度洗脫，在 280 nm 下可有效分離 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白。
NY/T 4630-2025
賽默飛完整應用解決方案
01
樣品前處理
1.1 液體試樣：低溫奶（生牛乳、巴氏殺菌乳）/ 常溫奶（超高溫(UHT)滅菌乳）
稱取試樣 5 g(精確到0.1 mg)于 50 mL 帶刻度旋蓋離心管中，加適量水渦旋混勻 30 s，用適量乙酸調節(jié) pH 為 4.60±0.05 后，用水定容至 25.0 mL，渦旋混勻 1 min，靜置 30 min 以上，12000 rpm 4 ℃ 離心 15 min。取上清液(可酌情用超純水進行稀釋)，過 0.2 μm 親水性 PTFE 微孔濾膜 (P/N: 42213-NPL)，濾液待上機測試。
1.2 固體試樣：乳粉（嬰幼兒配方奶粉）
稱取試樣 2 g(精確到0.1 mg)于 50 mL 帶刻度旋蓋離心管中，加適量水渦旋混勻 1 min 使其充分溶解(必要時可溫水浴化開)，用適量乙酸調節(jié) pH 為 4.60±0.05 后，用水定容至 25.0 mL，渦旋混勻 1 min，靜置 30 min 以上，12000 rpm 4 ℃ 離心 15 min。取上清液(可酌情用超純水進行稀釋)，過 0.2 μm 親水性 PTFE 微孔濾膜 (P/N: 42213-NPL)，濾液待上機測試。
02
儀器配置及色譜條件
Thermo Scientific™ Vanquish Core™ 高效液相色譜系統(tǒng)，配置：泵 Quaternary Pump C (VC-P20-A)，自動進樣器 Split Sampler CT (VC-A12-A)，柱溫箱 Column Compartment C (VC-C10-A)，檢測器 Diode Array Detector CG (VC-D11-A)，數(shù)據(jù)處理 Chromeleon™ 7.3
色譜柱：Accucore 150 C4, 2.6 μm, 4.6×150 mm (P/N: 16526-154630)
流動相：A: 0.1% 三氟乙酸水 B: 0.1% 三氟乙酸乙腈
流速：0.8 mL/min
梯度洗脫程序：
進樣量：10 µL
柱溫：60 ℃
檢測器：DAD, 采集波長: 210 nm；采集頻率: 10 Hz；光譜采集: 190-400 nm
03
譜圖及數(shù)據(jù)
3.1 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標準品溶液的分離譜圖及數(shù)據(jù)
圖 1 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標準品溶液的分離譜圖及數(shù)據(jù) (100 μg/mL)(點擊查看大圖)
如圖 1 所示，α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白色譜峰形良好，柱效優(yōu)異，分離度優(yōu)于標準。α-乳白蛋白保留時間為 21.900 min，不對稱因子 0.98，理論塔板數(shù) 321137；β-乳球蛋白 B 保留時間為 24.747 min，不對稱因子 1.01，理論塔板數(shù) 352451；β-乳球蛋白 A 保留時間為 25.467 min，不對稱因子 1.00，理論塔板數(shù) 373359。α-乳白蛋白與 β-乳球蛋白 B 分離度為 17.77，β-乳球蛋白 B 與 β-乳球蛋白 A 分離度為 4.33。
3.2 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白單一標準品溶液定位疊加譜圖
圖 2 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白單一標準品溶液定位疊加譜圖(點擊查看大圖)
α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白單標定位色譜圖及光譜圖，如圖 2 所示，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白 B 和 β-乳球蛋白 A 均在 200 nm 和 279 nm 處有特征吸收。
3.3 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標準品溶液連續(xù)進樣疊加譜圖
圖 3 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標準品溶液連續(xù)進樣疊加譜圖 (100 μg/mL, n=4)(點擊查看大圖)
α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標準品溶液 (100 μg/mL) 連續(xù)四次進樣，保留時間和峰面積的 RSD 均小于 0.3%，方法重現(xiàn)性好，分離譜圖及數(shù)據(jù)詳見圖 3。
3.4 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白標準品溶液校準曲線疊加譜圖
圖 4 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白標準品溶液校準曲線疊加譜圖 (0.00/40.0/80.0/120/160/200 μg/mL)(點擊查看大圖)
生牛乳、巴氏殺菌乳中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的含量通常都較高，因而選取了 T/TDSTIA 002-2021 和 T/TDSTIA 007-2019 兩個團體標準推薦的線性范圍。如圖 4 所示，α-乳白蛋白標準品溶液線性范圍 0.00-200 μg/mL，線性相關系數(shù) r2≥0.9997，β-乳球蛋白標準品溶液線性范圍 0.00-200 μg/mL，線性相關系數(shù) r2≥0.9991，線性良好。其中 β-乳球蛋白 B 和 β-乳球蛋白 A 采用化合物組進行定量。
3.5 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白標準品溶液 (40.0 μg/mL) 與空白溶液疊加譜圖
圖 5 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白標準品溶液 (40.0 μg/mL) 與空白溶液疊加譜圖(點擊查看大圖)
當進樣體積為 10 uL 時，以 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白 (40.0 μg/mL) 的峰高為 S，選取 22.5-24.0 min 基質噪音的平均值為 N，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白 B 和 β-乳球蛋白 A 的信噪比 S/N 分別為 523.3、139.9 和 133.6，如圖 5 所示。因此，配合進樣體積的優(yōu)化，α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白測定方法靈敏度亦可滿足 NY/T 4630-2025 中 1.00 μg/mL 的要求。
3.6 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標準品溶液與巴氏殺菌乳樣品溶液疊加譜圖
圖 6 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白混合標準品溶液與巴氏殺菌乳樣品溶液疊加譜圖(點擊查看大圖)
除乳清蛋白外，牛乳中還含有大量的酪蛋白和其他蛋白，可能會對 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的測定產生干擾。巴氏殺菌乳樣品經(jīng)調節(jié) pH 、高速離心等前處理操作后，未變性的 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白保留在上清液中，其分離保留的峰型較好、基線平穩(wěn)且出峰時無干擾，如圖 6 所示。采用外標法定量，巴氏殺菌乳樣品中 α-乳白蛋白為 1033.6 mg/kg和 β-乳球蛋白含量為 2949.0 mg/kg，基本與標簽值相符。
3.7 巴氏殺菌乳（低溫奶）、超高溫滅菌乳（常溫奶）及嬰幼兒配方奶粉樣品溶液分離譜圖及數(shù)據(jù)
圖 7 巴氏殺菌乳(低溫奶)樣品溶液分離譜圖及數(shù)據(jù)
(點擊查看大圖)
圖 8 超高溫滅菌乳(常溫奶)樣品溶液分離譜圖及數(shù)據(jù)
(點擊查看大圖)
圖 9 嬰幼兒配方奶粉樣品溶液分離譜圖及數(shù)據(jù)
(點擊查看大圖)
α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白對溫度較敏感，高溫會破壞其化學結構及生物活性。如圖 7-9 所示，巴氏殺菌乳(低溫奶)中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白目標峰附近均不存在明顯干擾峰，可準確定性和定量，生牛乳、巴氏殺菌乳等樣品適用于 NY/T 4630-2025 第一法；而超高溫滅菌乳(常溫奶)和嬰幼兒配方奶粉中 β-乳球蛋白目標峰附近存在明顯干擾峰，會嚴重影響定性和定量結果，α-乳白蛋白受影響相對較小，超高溫滅菌乳、嬰幼兒配方奶粉等樣品不適用于 NY/T 4630-2025 第一法，建議采用第二法。
3.8 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白標準溶液凝膠滲透色譜圖（第二法）
圖 10 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白標準溶液 (500 mg/L) 凝膠滲透色譜圖(點擊查看大圖)
參考杜茹蕓老師在《中國乳品工業(yè)》期刊發(fā)表的文章《體積排阻色譜法測定牛奶、乳粉、乳清粉中 α-乳白蛋白的含量》(2022 年)，串聯(lián)使用兩支 MAbPac SEC-1 (300 Å, 5 μm, 7.8×300 mm) 體積排阻色譜柱，以 6 M 鹽酸胍為流動相進行等度洗脫，在 280 nm 下可有效分離 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白(如圖 10 所示)，并測試了 60 個批次的牛奶、奶粉及乳清粉，以驗證方法適用性和穩(wěn)定性，相關譜圖及數(shù)據(jù)詳見原文。
文中選用 MAbPac SEC-1 色譜柱規(guī)格為 7.8×300 mm，推薦流速為 0.5 mL/min，在確保分離度的前提下實現(xiàn)溶劑節(jié)省，可選用 4.0×300 mm 規(guī)格色譜柱，建議流速為 0.2 mL/min (可酌情適當調整)。
04
NY/T 4630-2025 相關色譜耗材推薦
4.1 第一法 反相液相色譜法 分析柱及保護柱
Accucore 150 C4, 2.6 μm, 4.6×150 mm
(P/N: 16526-154630)
Accucore 150 C4 保護柱柱芯, 2.6 μm, 4.0×10 mm, 4 pk
(P/N: 16526-014005)
Uniguard 直連式保護柱柱套
(P/N: 850-00)
4.2 第二法 凝膠滲透色譜法 分析柱及保護柱
流速：0.5mL/min
保護柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4.0×50 mm
(P/N: 074697)
分析柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 7.8×300 mm
(P/N: 088460)
分析柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 7.8×300 mm
(P/N: 088460)
流速：0.2mL/min
保護柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4.0×50 mm
(P/N: 074697)
分析柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4.0×300 mm
(P/N: 074696)
分析柱：MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4.0×300 mm
(P/N: 074696)
4.3 樣品前處理
Titan 3 親水性 PTFE 針式過濾器，17 mm, 0.2 μm, 200/pk
(P/N: 42213-NPL)
05
參考文獻
[1] NY/T 4630-2025 牛乳及其制品中 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的測定 高效液相色譜法
[2] T/TDSTIA 026-2022 嬰幼兒配方乳粉中 α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的測定-凝膠滲透色譜法
[3] T/TDSTIA 002-2021 奶及奶制品中 α-乳白蛋白的測定 高效液相色譜法
[4] T/CSIQ 77001-2020 乳制品中 α-乳白蛋白含量的測定 高效液相色譜法
[5] T/TDSTIA 007-2019 奶及奶制品中 β-乳球蛋白的測定 液相色譜法
[6] T/SHNX 001-2025 生牛乳中乳鐵蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法
[7] 杜茹蕓,王亮,林毅侃.體積排阻色譜法測定牛奶、乳粉、乳清粉中 α-乳白蛋白的含量[J].中國乳品工業(yè),2022,50(04):46-51.
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