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ToneScript cDNA*鏈合成試劑盒是專(zhuān)門(mén)用于兩步法RT-PCR的*步，含有合成高質(zhì)量*鏈cDNA所需的所有成分，適用于后續(xù)的PCR、qPCR以及基因克隆。那么在實(shí)際操作中會(huì)有哪些常見(jiàn)問(wèn)題呢？一起來(lái)了解一下：

1、 沒(méi)有RT-PCR產(chǎn)物或產(chǎn)量低

◆RNA模板降解。RNA 的純度和完整對(duì)于反轉(zhuǎn)錄得到全長(zhǎng)cDNA是非常重要的。提取的RNA應(yīng)進(jìn)行電泳檢測(cè)以確定其是否降解。同時(shí)RNA要避免多次反復(fù)凍融。

◆RNA模板純度低。提取RNA的過(guò)程中，可能殘留一些鹽離子、試劑，如 EDTA、酚、胍鹽、磷酸鹽、多胺等抑制接下來(lái)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。建議用75%乙醇（DEPC 水配制）仔細(xì)清洗RNA沉淀。

◆引物不合適。選擇合適的引物，當(dāng)RNA是細(xì)菌RNA或者是沒(méi)有polyA尾的RNA要選擇隨機(jī)引物或者特異引物。

◆目的基因含有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或高GC含量。建議選擇隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄溫度提高至55℃。

2、RT-PCR 產(chǎn)物比預(yù)期長(zhǎng)

◆RNA 中很可能污染了DNA。真核生物基因組DNA中含有內(nèi)含子，可能參與了 PCR擴(kuò)增，可以在反轉(zhuǎn)錄之前對(duì)RNA進(jìn)行DNaseI的消化。

3、陰性對(duì)照中有RT-PCR產(chǎn)物

◆陰性對(duì)照中有RT-PCR產(chǎn)物也表明有DNA的污染。在反轉(zhuǎn)錄之前對(duì)RNA進(jìn)行DNase I 的消化。