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雙抗體夾心法
1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋蛋白質含量為1~10μg/ml.在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃隔夜.次日,棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘.(簡稱洗滌,下同).
2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時.然后洗滌.(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔).
3. 加酶標抗體:于各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml.37℃孵育0.5~1小時,洗滌.
4. 加底物液顯色:于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分鐘.
5. 終止反應:于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml.
6. 結果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以“+"、“-"號表示.也可測OD值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調零后測各孔OD值,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性.
間接法
1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃隔夜;
2.次日洗滌3次;
3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌;
4.(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml;
5.37℃孵育35-60分鐘,洗滌;
6.’zui后一遍用DDW洗滌.
其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6.
發(fā)展前景
臨床測定技術的發(fā)展主要在于方法學的發(fā)展,而方法學的發(fā)展依托于試劑生產技術不斷進步更新和型標記物的應用.分子生物學正在并zui終肯定會讓對整個生命科學有一個全面而*的認識,其對免疫測定技術發(fā)展的影響也是直接而又有效的,對以前一些難以檢測的生物活性物質的測定,并且大大提高了檢測的靈敏度和特異性.
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