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生命中心李海濤研究組于《自然化學(xué)生物學(xué)》（Nature Chemical Biology）正式發(fā)表題為《應(yīng)用蛋白陣列技術(shù)研發(fā) Spindlin1 小分子抑制劑》（Developing spindlin1 small-molecule inhibitors by using protein microarrays）的合作研究論文，通過構(gòu)建組蛋白閱讀器結(jié)構(gòu)域蛋白芯片，并結(jié)合基于結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系演化，開發(fā)出專門針對(duì) Spindlin1 的活性小分子抑制劑，為今后模式結(jié)構(gòu)域（modular domain）靶向的藥物篩選與開發(fā)提供了一種新技術(shù)模式。

圖 1 利用蛋白陣列篩選小分子抑制劑

組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控基本機(jī)制之一，被認(rèn)為構(gòu)成一類“組蛋白密碼”，調(diào)控著遺傳信息在染色質(zhì)層面的組織與解讀。組蛋白修飾的一種作用模式是招募一類被稱作“閱讀器”（reader）的效應(yīng)因子，通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)開關(guān)狀態(tài)而調(diào)控基因活度和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響細(xì)胞分裂、增殖、分化和凋亡等眾多細(xì)胞進(jìn)程。值得注意的是，在癌癥等眾多疾病中存在組蛋白修飾及其“閱讀器”識(shí)別紊亂調(diào)控的現(xiàn)象。近年來，組蛋白“閱讀器”逐漸成為藥物研發(fā)中的一類重要靶點(diǎn)，一個(gè)的例子是 BRD4 的 Bromo 結(jié)構(gòu)域。能夠識(shí)別組蛋白修飾的“閱讀器”結(jié)構(gòu)域種類繁多，如 PHD 鋅指、Tudor、Chromo、PWWP、MBT、BAH、Bromo、YEATS 等，他們能夠以修飾位點(diǎn)和類型特異的方式來識(shí)別并破譯“組蛋白密碼”。因此，尋找針對(duì)組蛋白閱讀器的特異抑制劑，是當(dāng)前表觀遺傳領(lǐng)域藥物研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

組蛋白甲基化是一類重要的組蛋白修飾，主要發(fā)生在賴氨酸和精氨酸等殘基上，通?？梢员?ldquo;閱讀器”中的芳香籠口袋（aromatic cage）識(shí)別并解讀。鑒于芳香籠口袋的結(jié)構(gòu)相似性，開發(fā)特異靶向不同甲基化“閱讀器”的小分子抑制劑成為一個(gè)領(lǐng)域挑戰(zhàn)。本研究首先通過構(gòu)建組蛋白賴氨酸甲基化“閱讀器”結(jié)構(gòu)域蛋白陣列芯片，其中涉及隸屬 Tudor、Chromo、PHD、BAH、MBT、PWWP、ANK、AGENET、HEAT 等類型的蛋白結(jié)構(gòu)域共 98 個(gè)；隨后，采用一種基于熒光的檢測手段對(duì)生物素標(biāo)記的小分子抑制劑進(jìn)行針對(duì)該 98 個(gè)潛在“閱讀器”靶點(diǎn)的“lab-on-chip”高通量評(píng)估和篩選。利用該項(xiàng)技術(shù)研究組成功篩選出 EML405 小分子的潛在靶點(diǎn) Spindlin1、PHF20、L3MBTL1、53BP1 等，并在體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。

李海濤研究組曾于 2014 年在《基因與發(fā)育》發(fā)文報(bào)導(dǎo) Spindlin1 是一類新型組蛋白“閱讀器”，其含有三個(gè)串聯(lián)重復(fù)類 Tudor 結(jié)構(gòu)域，通過前兩個(gè)類 Tudor 結(jié)構(gòu)域特異性識(shí)別組蛋白“賴氨酸 - 精氨酸”甲基化組合，H3“K4me3-R8me2a”，進(jìn)而激活 Wnt 靶基因的轉(zhuǎn)錄，是結(jié)腸癌等諸多癌癥發(fā)生中的促癌因子。以 Spindlin1 為突破點(diǎn)，李海濤研究組通過 X 射線晶體衍射技術(shù)揭示了 EML405 小分子結(jié)合 Spindlin1 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn) EML405 小分子的兩臂恰巧結(jié)合在 Spindlin1 的前兩個(gè)功能性芳香族口袋中，阻斷其對(duì)組蛋白 H3“K4me3-R8me2a”的識(shí)別。在 Spindlin1-EML405 的復(fù)合物結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，研究人員進(jìn)一步優(yōu)化出 EML405 小分子的衍生體 EML631、EML632、EML633，并系統(tǒng)的開展了 EML631-633 與 Spindlin1、PHF20、L3MBTL1、L3MBTL3、53BP1 靶點(diǎn)的定性、定量結(jié)合分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn) EML 衍生小分子能夠大大提高 Spindlin1 靶點(diǎn)的識(shí)別特異性，其中 EML631 以 4 微摩爾親和力結(jié)合 Spindlin1，而對(duì) PHF20、L3MBTL1、L3MBTL3、53BP1 靶點(diǎn)的結(jié)合能力降到亞毫摩爾級(jí)別。Spindlin1-EML631 的晶體結(jié)構(gòu)解析進(jìn)一步揭示了 EML631 對(duì) Spindlin1 高度選擇性的分子機(jī)制。同時(shí)，RNA-seq 和 ChIP-qPCR 結(jié)果顯示，EML631 能夠有效抑制 Spindlin1 激活基因轉(zhuǎn)錄的活性。因此，本工作以組蛋白“閱讀器”蛋白芯片為切入點(diǎn)，開發(fā)出針對(duì) Spindlin1 靶點(diǎn)的特異性小分子抑制劑，這為今后以模式結(jié)構(gòu)域?yàn)榘悬c(diǎn)的特異小分子篩選開發(fā)建立了一個(gè)新型研發(fā)模式。

本論文是李海濤教授與美國得克薩斯大學(xué) MD 安德森癌癥中心 Mark Bedford 教授、意大利薩萊諾大學(xué) Gianluca Sbardella 教授共同合作成果。其中李海濤教授實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)了結(jié)構(gòu)解析與結(jié)合實(shí)驗(yàn)、Mark Bedford 教授實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)了蛋白陣列制備與細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)、Gianluca Sbardella 教授實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)了小分子化學(xué)合成與演化工作。生命科學(xué)聯(lián)合中心博士后蘇曉楠為論文并列*作者，清華大學(xué) 2016 級(jí)博士生白雪參與了該項(xiàng)工作。本課題得到科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、教育部自主科研計(jì)劃、生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心等資助。衍射數(shù)據(jù)收集得到上海同步輻射光源 BL17U 線站的大力支持與協(xié)助。