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上海隆壘生物科技有限公司 |
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WORD 文檔 |
【詳細說明】 單細胞凝膠電泳的操作步驟
1、分離制備單細胞懸液
?。?）體外培養(yǎng)的細胞株：用胰酶消化，吹打成單細胞懸液。
（2）體內(nèi)臟器細胞：處死動物，取出臟器，于Hank’s液中制備成單個細胞懸液。
2、膠板制備
（1）取20~50μl于56℃水浴中保溫的0.5%普通熔點瓊脂糖，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠。
（2）取100~150μl0.5%普通熔點瓊脂糖加在底膠上，再于其上加蓋玻片，4℃冷凝10分鐘。
?。?）取下蓋片，取50~100μl于37℃水浴中保溫的1.0%的低熔點瓊脂糖與50~100μl細胞懸液（105個細胞/ml）混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4℃冷凝10分鐘。
?。?）去掉蓋玻片，取70~100μl于37℃水浴中保溫的0.5%的低熔點瓊脂糖鋪片，加蓋玻片，4℃冷凝。
3、細胞裂解與電泳
?。?）將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預冷的細胞裂解液中，4℃裂解1小時。
?。?）取出膠板，放入電泳槽中，浸泡在電泳液中解旋20分鐘。
（3）4℃電泳20分鐘（25V，300mA）。
4、中和與染色：
（1）電泳結束，將膠板浸泡于中和液中，每次15分鐘，共中和兩次，注意更換中和液。
?。?）取出膠板，置于染色架上，滴加5μg/ml的PI，暗處染色20分鐘。
?。?）蒸餾水脫色15分鐘。
5、鏡檢和分析：
?。?）在熒光顯微鏡下觀察，綠光激發(fā)吸收濾片590nm，必要時照相記錄。
?。?）記數(shù)觀察的細胞，記錄彗星細胞出現(xiàn)的頻率，用目鏡測微尺測頭長與全長，計算核DNA遷移距離。
