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　　哺乳動物細(xì)胞冷凍保存
　　
　　主要目的：
　　
　?。?）保存種子細(xì)胞，以便隨時(shí)取用。這是保存細(xì)胞的zui主要目的。
　　
　?。?）減少細(xì)胞被微生物污染的危險(xiǎn)性。
　　
　?。?）減少細(xì)胞之間交叉污染的危險(xiǎn)性。
　　
　?。?）減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。
　　
　?。?）避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。
　　
　　（6）降低人力和物力。
　　
　　冷凍保存要點(diǎn)：
　　
　?。?）冷凍過程要緩慢。需要冷凍保存的細(xì)胞先在4℃冰箱中放置30－60分鐘；然后轉(zhuǎn)入-20℃，放置30分鐘；然后再轉(zhuǎn)入-80℃放置16－18小時(shí)（或過夜）；zui后放入液氮中長期保存。有條件的地方，可用程控降溫儀，按每分鐘-1到-3℃速度降溫，一直到-80℃以下，然后直接放入液氮中長期保存。
　　
　?。?）凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。
　　
　?。?）細(xì)胞濃度控制在：1×107－5×107/ml。
　　
　?。?）使用高濃度血清或蛋白保護(hù)劑。一般情況下，用于冷凍保存*細(xì)胞生長培養(yǎng)液中血清濃度大于20％。
　　
　?。?）使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑，以保護(hù)細(xì)胞在冷凍過程中免受冰晶破壞。目前，zui常用的冷凍保護(hù)劑是DMSO（二甲基亞砜），使用終濃度為5－10％。但是，有些細(xì)胞系不能用DMSO作為冷凍保護(hù)劑，如人白血病細(xì)胞系HL-60。因?yàn)?，DMSO能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化。在這種情況下，可選用其它冷凍保護(hù)劑，如甘油（glycele）等。
　　
　　特別注意：
　　
　?。?）細(xì)胞在冷凍過程中在-20℃冰箱內(nèi)放置時(shí)間不可超過1小時(shí)，以防止冰晶過大而破壞細(xì)胞。也可跳過-20℃這一步驟直接放入-80℃冰箱中，但這樣做細(xì)胞存活率要低一些。
　　
　?。?）DMSO稀釋時(shí)會釋放大量熱量。因此，DMSO不能直接加到細(xì)胞液中，必須事先配制。
　　
　?。?）DMSO必須是細(xì)胞培養(yǎng)級別的。新買的DMSO本身處于無菌狀態(tài)，*次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管或瓶中，4℃保存。避免反復(fù)凍融造成DMSO裂解產(chǎn)生有害物質(zhì)。并可減少污染機(jī)會。如要過濾DMSO，必須選用耐DMSO的尼龍濾膜。細(xì)胞冷凍保存液主要成分：冷凍保護(hù)劑，基礎(chǔ)培養(yǎng)液，血清或蛋白。
　　
　　常用細(xì)胞冷凍保存液：
　　
　　（1）10％DMSO＋*細(xì)胞生長培養(yǎng)液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
　　
　?。?）10％甘油＋*細(xì)胞生長培養(yǎng)液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）懸浮細(xì)胞冷凍保存操作程序（液氮保存法）：
　　
　　（1）取對數(shù)生長期細(xì)胞培養(yǎng)物，離心200－400g5分鐘。用粘附（貼壁）細(xì)胞冷凍保存操作程序（液氮保存法）：
　　
　?。?）冷凍保存細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇要點(diǎn)：（1）快速解凍。凍存細(xì)胞從液氮中取出后，應(yīng)立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘）。
　　
　?。?）解凍操作過程動作要輕。由于冷凍保存過的細(xì)胞變得非常脆弱，不僅解凍速度要快，而且動作要輕。一般情況下，解凍后的細(xì)胞可直接接種到含*生長培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)（1ml凍存細(xì)胞液加入到25－30ml新鮮*培養(yǎng)液中），24小時(shí)后再用新鮮*培養(yǎng)替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。如果，細(xì)胞對冷凍保護(hù)劑特別敏感，那么，解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。
　　
　　特別注意：
　　
　?。?）解凍時(shí)務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。，要帶手套，用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出，放入37℃水浴中。切不可直接用手，以免凍傷。
　　
　?。?）冷凍管在水浴中解凍時(shí)，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污染。
　　
　　解凍冷凍保存細(xì)胞的離心方法:
　　
　?。?）從液氮中取出凍存的細(xì)胞，立即放入37℃水浴中快速解凍。
　　
　?。?）將1－2ml凍存細(xì)胞液加入到25ml新鮮*細(xì)胞生長培養(yǎng)液中，輕輕混勻。
　　
　?。?）用80g離心2－3分鐘，棄上清液。
　　
　?。?）用*生長培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團(tuán)，并計(jì)數(shù)細(xì)胞。
　　
　　（5）接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為3×105/ml。