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注意：正式實驗之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

蛋白質(zhì)羰基是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過程中的早期標(biāo)志，其含量高低表明蛋白質(zhì)氧化損傷程度的大小，是衡量蛋白質(zhì)氧化損傷的主要指標(biāo)。

測定原理：

羰基與2,4-二硝基肼反應(yīng)生成紅色2,4-二硝基腙，在370nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器：

天平、恒溫水浴鍋、低溫離心機、漩渦震蕩儀、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水、無水乙醇、乙酸乙酯。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑0.1g×5支，4℃避光保存。（使用前根據(jù)樣品數(shù)，每支加1mL水溶解，每支為10個樣品用量）

試劑二：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體6mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體15mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：根據(jù)測定樣品量，將乙酸乙酯和無水乙醇等體積混合。

試劑六：液體60mL×1瓶，4℃保存。

樣品處理：

組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，于4℃，4000g離心10min，取上清，加入0.1mL試劑一，室溫放置10min，4℃，10000g離心10min，取上清待測。

細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

血清等液體樣本：直接測定。

測定步驟和操作表：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至370nm。

2. 操作表

計算公式：

a．用微量石英比色皿測定的計算公式如下

按照樣本蛋白濃度計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) =0.227×ΔA370÷Cpr

按照樣本重量計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/g 鮮重）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA370÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/104cell）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(細(xì)胞數(shù)量 ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA370÷細(xì)胞數(shù)量

按照液體體積計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mL）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷V樣=0.227×ΔA370

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3 mL；ε：羰基毫摩爾消光系數(shù)，22 L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.06 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，W：樣本質(zhì)量，g

2. 用96孔板測定的計算公式如下

1. 按照樣本蛋白濃度計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) =0.454×ΔA370÷Cpr

2. 按照樣本重量計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/g 鮮重）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總) =0.454×ΔA370÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/104cell）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷(細(xì)胞數(shù)量 ×V樣÷V樣總) =0.454×ΔA370÷細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計算

蛋白質(zhì)羰基含量（μmol/mL）= [ΔA370×V反總÷（ε×d）]÷V樣=0.454×ΔA370

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3 mL；ε：羰基毫摩爾消光系數(shù)，22 L/mmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.06 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，W：樣本質(zhì)量，g

注意事項：

1. 試劑一使用前根據(jù)要測定的樣品數(shù)現(xiàn)配，配置好后4℃保存，若變?yōu)楹谏?，則不能使用。

2. 試劑二見光易分解，反應(yīng)需嚴(yán)格避光。

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