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測(cè)定意義：

ATP廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是生物能量通貨，能荷是描述細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。測(cè)定ATP含量并且計(jì)算能荷，能夠反映能量代謝狀態(tài)。

測(cè)定原理：

肌酸激酶催化肌酸和ATP反應(yīng)生成磷酸肌酸，可在700nm下用磷鉬酸比色法檢測(cè)磷酸肌酸含量，以此反應(yīng)ATP含量。

自備儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。

試劑組成和配制：

酸性提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

堿性提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑二：液體1.5mL×1支，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入500μL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：液體5mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：液體25mL×1瓶，4℃保存；

標(biāo)準(zhǔn)液：液體10mL×1瓶，2μmol/mLATP標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存；

 ATP提取：

1、血清（漿）中ATP的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一EP管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。

2、組織中ATP的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4℃離心10min，取上清至另一EP管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。

3、細(xì)胞或細(xì)菌中ATP的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：酸性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL酸性提取液），超聲波破碎1min（冰浴，強(qiáng)度20％或200W，超聲2s，停1s），8000g 4 ℃離心10min；取上清液至另一EP管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，8000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到700nm，蒸餾水調(diào)零。

2、顯色劑的配制：臨用前請(qǐng)根據(jù)擬用顯色劑體積（樣本數(shù)×0.2 m L），按試劑四(mL)：試劑五（mL）=1：5的比例配制。用多少配多少。

3、樣本測(cè)定：

充分混勻，37℃準(zhǔn)確水浴30min

37℃水浴20min后，700nm下測(cè)定各管吸光值

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管通常只需要各做一個(gè)。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

ATP含量計(jì)算：

1、血清（漿）中ATP含量計(jì)算

ATP含量(μmol/mL)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管－A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ×V1]÷(V3×V1÷V2)=40×(A測(cè)定管－A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ATP含量計(jì)算

（1）按蛋白濃度計(jì)算

ATP含量(μmol/mg prot)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管－A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ×V1]÷(V1÷Cpr）=2×(A測(cè)定管－A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷Cpr

蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。

（2）按樣本鮮重計(jì)算

ATP含量(μmol/g鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管－A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ×V1]÷(W×V1÷V2)=4×(A測(cè)定管－A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

ATP含量(μmol/104 cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管－A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ×V1]÷(500×V1÷V2)=0.008×(A測(cè)定管－A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)液濃度，2μmol/mL；V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。

注意：檢測(cè)限為10nmol/mL或10nmol/g鮮重或0.1nmol/mg prot

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