免疫熒光技術(Immunofluorescence technique )又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。以熒光抗體方法較常用。 用免疫熒光技術顯示和檢查細胞或組織內抗原或半抗原物質等方法稱為免疫熒光細胞(或組織)化學技術。

免疫細胞熒光實驗流程：

1、細胞爬片制備

1）、將蓋玻片放入培養(yǎng)瓶或多孔板中

2）、細胞生長達到60％后取出蓋玻片

3）、用PBS清洗蓋玻片3次

4）、將蓋玻片（細胞面朝上）浸入冷丙酮或4％多聚甲醛或中性福爾馬林中10至20分鐘（蓋

上蓋子以防止蒸發(fā)）

5）、用PBS清洗蓋玻片3次

6）、將蓋玻片放在濾紙上（細胞朝上）

7）、干燥8-10小時，放入-20°C保存

8）、實驗前解凍爬片，在室溫下用中性PBS浸泡10-15分鐘

注意：使用多聚甲醛和福爾馬林固定可能會導致綠色光譜中的自發(fā)熒光。在這種情況下，可以嘗試紅色或紅外的熒光素。

2、破膜

1）、0.1％Triton孵育10min

2）、PBS洗滌3次，每次3分鐘

3、抗原修復

1）、用濾紙擦干細胞爬片

2）、在爬片上加入如胰蛋白酶或其它酶抗原修復液

3）、在室溫下孵育10分鐘

4）、用PBS洗滌3次，每次10分鐘

4、封閉

1）、在爬片上加入5％BSA封閉液（種屬與二抗來源相同）

2）、37°C孵育30分鐘

3）、甩掉多余的液體并用濾紙擦干（不需要洗滌）

5、一抗孵育

1）、用抗體稀釋液稀釋一抗，達到抗體制造商推薦的濃度

2）、將稀釋的抗體（推薦濃度：0.4μg至2μg）加到爬片上，4°C孵育過夜

3）、用PBS洗滌3次，每次15分鐘

6、二抗孵育

1）、用抗體稀釋液稀釋生物素化的二抗

2）、將稀釋的抗體加到爬片上，37°C孵育30分鐘

3)、用PBS洗滌3次，每次8分鐘

7、染色

1)、爬片上滴加稀釋好的SABC-FITC或SABC-Cy3試劑

2）、37°C孵育30分鐘（避光）

3）、用PBS洗滌2次

4）、滴加DAPI染液，避光孵育10min

5）、用PBS洗滌3次

6）、用抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察結果。

實驗流程圖如下：