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用來(lái)檢測(cè)雞血清中的禽呼腸孤病毒抗體

【試驗(yàn)原理】
禽呼腸孤病毒被認(rèn)為與病毒性關(guān)節(jié)炎、發(fā)育遲緩綜合征、呼吸系統(tǒng)疾病、腸熱病、吸收障礙綜合癥和骨質(zhì)疏松有關(guān)，從未發(fā)病的雞中也可分離到呼腸孤病毒，根據(jù)宿主日齡、毒力和接觸病毒途徑的不同，病毒誘發(fā)疾病的的性質(zhì)、癥狀和嚴(yán)重程度也不同，雞血清中的禽呼腸孤病毒抗體水平及整個(gè)雞群的免疫狀況可用ELISA方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
將滅活的抗原包被在微孔板上，加入稀釋后的血清并孵育。血清中的所有抗REO抗體將與微孔板上的REO抗原結(jié)合并形成REO抗原-抗體復(fù)合物，然后洗掉未結(jié)合的物質(zhì)，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗雞的IgG（結(jié)合物）至微孔板中，結(jié)合物將與REO抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，孵育后洗掉未結(jié)合的結(jié)合物，加入底物溶液。底物與堿性磷酸酶發(fā)生反應(yīng)形成黃色的物質(zhì)。zui后，終止反應(yīng)，將顏色固定。顏色的深淺可用酶標(biāo)儀（405-410nm）測(cè)定。

【一個(gè)微孔板所需的試劑的量】

抗原包被微孔板	12×8條（板）
樣品稀釋液（1×）	120ml
洗滌液（1×）	500ml
陽(yáng)性對(duì)照	2μl
陰性對(duì)照	2μl
結(jié)合物	12ml
底物液	12ml
終止液	12ml

【所需物品】
1. 能夠吸取2μl、100μl和800μl的精確移液器
2. zui大吸取100μl的多通道移液器
3. 計(jì)時(shí)器
4. 量筒
5. 蒸餾水
6. 洗板機(jī)
7. 稀釋用容器
8. 能夠讀雙波（405-410nm和630-650nm）的酶標(biāo)儀，OD值讀數(shù)zui大可達(dá)到3.0

【樣品收集】
采集至少0.5ml全血，分離血清并放在冰箱里，2-7℃用于短期儲(chǔ)存，如果長(zhǎng)期儲(chǔ)存，應(yīng)冷凍，且避免反復(fù)凍溶。如果樣品含有可見(jiàn)的顆粒物質(zhì)，應(yīng)在檢測(cè)之前將其離心除去，嚴(yán)重污染的樣品不允許使用（如高度渾濁、細(xì)菌污染等）

【結(jié)果計(jì)算】
將陽(yáng)性對(duì)照吸光度值和樣品吸光度值分別減去陰性對(duì)照吸光度值，注意：對(duì)照品及樣品吸光度值都應(yīng)該是2個(gè)重復(fù)孔的平均值。每個(gè)樣品的計(jì)算式如下：

樣品平均吸光度值－陰性對(duì)照吸平均吸光度值	＝樣品與陽(yáng)性對(duì)照比值（Sp）
陽(yáng)性對(duì)照平均吸光度值－陰性對(duì)照平均吸光度值

Sp ×（100）＝ ELISA Unit （EU）              陽(yáng)性對(duì)照值設(shè)為100 EU

【結(jié)果判定及EU單位說(shuō)明】
REO ELISA 值                        說(shuō)明
小于10EUs                            REO抗體為陰性
10-25 EUs                            REO抗體為弱陽(yáng)性，應(yīng)被認(rèn)為經(jīng)過(guò)免疫或暴露于REO，油乳狀疫苗也可能引起非特異性低水平抗體。
25-75 EUs                             REO抗體適度陽(yáng)性
＞75 EUs                              REO抗體強(qiáng)陽(yáng)性

【操作步驟】
1. 將試劑回溫至室溫，通過(guò)顛倒和渦旋將試劑混勻。
2. 將1份4×樣品稀釋液加入到含3份去離子水的容器中，充分混勻，例如，30ml 4×樣品稀釋液加入到90ml去離子水中。
3. 將1份20×洗滌液加入到含19份去離子水的容器中，充分混勻，例如，25ml 20×洗滌液加入到475ml去離子水中。
4. 稀釋前將陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和樣品震蕩均勻。
5. 陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和樣品均需要用樣品稀釋液稀釋后使用。稀釋比例為2μl ：800μl。將移液器調(diào)到100μl，反復(fù)吹打4次使之充分混勻。
6. 將稀釋后的陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照分別加入微孔中，每種做兩個(gè)平行，每孔100μl；將稀釋后的樣品100μl分別加入孔中，室溫下靜置30分鐘。
7. 棄去微孔板中溶液，每孔加入300μl洗滌液洗滌，重復(fù)洗滌2次，在洗滌過(guò)程中防止酶標(biāo)板變干。
8. 每孔立即加入100μl結(jié)合物，室溫靜置30分鐘。
9. 重復(fù)步驟7進(jìn)行洗板。
10. 每孔立即加入100μl底物，室溫靜置30分鐘。
11. 不要倒掉板內(nèi)液體，每孔立即加入100μl終止液。
12. 用酶標(biāo)儀雙波讀數(shù)（405nm或410nm作為主要波長(zhǎng)，630nm或650nm為參考波長(zhǎng)），計(jì)算結(jié)果。

【公司名稱】廣州健侖生物科技有限公司

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