Osteocalcin （1-43/49） Specific ELISA Kit

Catalog Number: KT-809

Storage：This test kit must be stored at 2 – 8°C upon receipt.

INTENDED USE

This ELISA （enzyme-linked immunosorbent assay） kit is intended for the quantitative determination of both human osteocalcin （1-49） and osteocalcin （1-43） （also referred as N-terminal & mid-regional osteocalcin） levels in test samples. This test is useful for assessing the bone formation activity or osteoblast activity in patients associated with changes in the rate of bone turnover in metabolic bone disease, such as osteoporosis, primary hyperparathyroidism, hyperthyroidism, Paget’s disease, and renal osteodystrophy.

INTRODUCTION

Osteocalcin [also as bone Gla protein （BGP）] is a major noncollagenous protein found in bone and dentin. The synthesis of osteocalcin involves vitamin K and vitamin D3. Freshly synthesized osteocalcin is partly released into the blood stream and partly incorporated into the bone matrix. Both osteocalcin （1-49） and its fragments including osteocalcin （1-43） are released into the blood stream. Serum osteocalcin （1-43） also generated by catabolic   breakdown of osteocalcin （1-49） in the circulation, liver, kidney, as well as by in vitro degradation during storage of samples, because a labile six-amino acid C-terminal sequence that, in vitro at room temperature, is easily cleaved off. There are several studies that have confirmed the measurement of the much more stable N-terminal and mid-regional osteocalcin [osteocalcin （1-43/49）] as being clinically useful, which may contribute to a more accurate assessment of the bone turnover rate. 

As osteocalcin is manufactured by osteoblasts, it is often used as a biochemical marker, or biomarker, for the bone formation process. It has been routinely observed that higher serum-osteocalcin levels are relatively well correlated with increases in bone mineral density （BMD） during treatment with anabolic bone formation drugs for osteoporosis, such as Forteo. In many studies, Osteocalcin is used as a preliminary biomarker on the effectiveness of a given drug on bone formation.

ASSAY PRINCIPLE

This ELISA is designed, developed and produced for the quantitative measurement of human osteocalcin （1-49） and （1-43） in serum or plasma sample. The assay utilizes the two-site “sandwich” technique with two selected antibodies that bind to different epitopes of human osteocalcin. 

Assay standards, controls and patient samples are added directly to wells of a microtiter plate that is coated with streptavidin. Subsequently, a mixture of biotinylated human osteocalcin N-terminal region specific polyclonal antibody and a peroxidase labeled human osteocalcin 20 – 43 region specific monoclonal antibody is added to each well. After the first incubation period, a “sandwich” of “biotinylated antibody - human osteocalcin – HRP-monoclonal antibody” is formed and this immunocomplex is also captured to the wall of microtiter plate via a streptavidin-biotin affinity binding. The unbound monoclonal antibodies and buffer matrix are removed in the subsequent washing step. A substrate solution in a timed reaction is then measured in a spectrophotometric microplate reader. The enzymatic activity of the immunocomplex bound to the wall of each microtiter well is directly proportional to the amount of human osteocalcin in a test sample. A standard curve is generated by plotting the absorbance versus the respective human osteocalcin concentration for each standard on point-to-point or 4 parameter curve fit. The concentration of human osteocalcin in test samples is determined directly from this standard curve.

REAGENTS: Preparation

1. Streptavidin Coated Microplate：96 wells 

2. HRP Conjugated Osteocalcin Antibody ：1vial× 1.2 mL

3. Biotinylated Osteocalcin Antibody：2 bottles× 12mL

4. ELISA Wash Concentrate，30X：1 bottle× 30mL

5. ELISA HRP Substrate ：1 bottle× 22mL

6. ELISA Stop Solution：1 bottle× 12mL

7. Human Osteocalcin Standards：6 vials

8. Human Osteocalcin Controls：2 vials

Short Assay Procedure:

1. Add 25 µL of standards, controls and patient samples into the designated microwell.

2.    Add 200 µL of antibody mixture to each well.

3.    Incubate 60 minutes at RT, shaking 350 rpm

4.    Wash each well 5 times.

5.    Add 200 µL of ELISA HRP Substrate into each of the wells.

6.    Cover and incubate plate at room temperature static for 20 minutes.

7.    Add 50 µL of ELISA Stop Solution into each of the wells.

8.    Read the absorbance at 450 nm.