纈沙坦是一種血管緊張素II受體阻滯劑（ARBs），用于治療高血壓和心力衰竭。2018年7月13日美國(guó)FDA發(fā)布通告，由于在某些纈沙坦藥品中檢測(cè)出一種潛在致癌物-N-二甲基亞硝胺（NDMA），因此需要召回市場(chǎng)上某些公司生產(chǎn)的纈沙坦產(chǎn)品。

關(guān)于亞硝類基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)方法，F(xiàn)DA發(fā)布了GC/MS、GC/MS/MS以及LC-HRMS（液相色譜-高分辨質(zhì)譜）的分析方法；對(duì)于沙坦類藥物，歐洲藥典委員的檢測(cè)方法包括GC/MS、GC/MS/MS、HPLC-UV和LC/MS/MS的分析方法。三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀使用多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的數(shù)據(jù)采集方式，是痕量化合物定量的黃金法則，本方案使用Chromai TQ5000 UHPLC-MS/MS，搭配大氣壓化學(xué)電離源（APCI）建立了纈沙坦片中四種基因毒性雜質(zhì)-NDMA、NDEA、N-nitrosoethylisopropylamine（NEIPA），N-nitrosodiisopropylamine（NDIPA）的檢測(cè)方法。

圖1亞硝胺結(jié)構(gòu)通式

四種亞硝胺標(biāo)品（NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA）使用前先用甲醇配制成濃度為1 mg/mL的獨(dú)立儲(chǔ)備液，再用甲醇稀釋成10 µg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，最后使用10%甲醇水溶液連續(xù)稀釋，得到系列線性標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取纈沙坦片一粒（含API 80 mg），準(zhǔn)確加入8.0 mL 10%甲醇水溶液（API濃度10 mg/mL），超聲提取10 min，12000 rpm離心5 min，上清液過(guò)0.22 µm濾膜，最后取20 µL濾液上機(jī)測(cè)試。

LC系統(tǒng)：科諾美 Frontier 超高效液相色譜系統(tǒng)

色譜柱：Lotus UHPLC C18色譜柱，2.7 µm, 3.0 mm × 100 mm

柱溫：40 ?C

流速：0.6 mL/min

流動(dòng)相A：0.1%甲酸

流動(dòng)相B：甲醇

質(zhì)譜系統(tǒng)：Chromai TQ5000

電離模式：APCI (+)

噴霧電壓：4000 v

離子源溫度：400℃

霧化氣：20 psi

氣簾氣：40 psi

*表示定量離子

LC/MS/MS方法優(yōu)化

本文考查了流動(dòng)相組分（0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲酸+2mM甲酸銨-甲醇）對(duì)色譜分離和質(zhì)譜響應(yīng)的影響，結(jié)果表明0.1%甲酸-甲醇的流動(dòng)相體系可獲得較好的色譜峰型和質(zhì)譜靈敏度。此外，樣品溶劑中的有機(jī)相比例不宜過(guò)高，否則會(huì)影響NDMA的峰型和靈敏度。相同色譜條件下，10mg/mL API的液相色譜圖如圖2所示，在NDIPA出峰之后，API出峰之前將流路設(shè)置為“引入廢液"，并采用高比例有機(jī)相充分洗脫API，避免污染質(zhì)譜系統(tǒng)。

在優(yōu)化后的條件下，四種亞硝胺之間及雜質(zhì)與API之間分離良好，0.5 ng/mL標(biāo)液的提取離子流圖如圖3所示，由結(jié)果可知，該濃度下四種亞硝胺雜質(zhì)靈敏度較好，S/N（ptp）均大于10。

圖2 10 mg/mL纈沙坦液相色譜圖

圖3 0.5 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子流圖

在0.5-100 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，四種亞硝胺化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.999（如圖4）；選擇1 ng/mL和100 ng/mL兩個(gè)濃度點(diǎn)，重復(fù)進(jìn)樣6針，峰面積和保留時(shí)間的重復(fù)性如表1和表2所示。

本方法的標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量限可到0.5 ng/mL，在樣品配制濃度為10 mg/mL的情況下，該方法定量限為0.05 ppm，滿足FDA的要求。

圖4 四種亞硝胺化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 混標(biāo)1 ng/mL保留時(shí)間和峰面積重復(fù)性

表2 混標(biāo)100 ng/mL保留時(shí)間和峰面積重復(fù)性

在樣品中加入四種基因毒性雜質(zhì)混標(biāo)，控制其在最終溶液中的濃度為1、20、50ng/mL，即相對(duì)于API加標(biāo)濃度為0.1、2、5 ppm，其余步驟按前述樣品制備完成。

由結(jié)果可知，三個(gè)加標(biāo)水平均在90%-105%之間（表3）。

表3 回收率結(jié)果

加標(biāo)樣品重復(fù)進(jìn)樣50針，考查儀器的系統(tǒng)壓力、目標(biāo)物保留時(shí)間與峰面積的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5所示。

由結(jié)果可知，在多次進(jìn)樣高濃度的API溶液情況下，系統(tǒng)壓力曲線基本重合，目標(biāo)物的分離和響應(yīng)穩(wěn)定。

圖5 方法耐用性考查

本文采用配備APCI源的Chromai TQ5000三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，同時(shí)檢測(cè)纈沙坦片中四種亞硝胺類化合物，由于搭配科諾美Frontier UHPLC超高效液相色譜，分析時(shí)間僅為10 min，且方法重現(xiàn)性好，靈敏度滿足目前FDA規(guī)定的要求。另外，通過(guò)質(zhì)譜切換閥將高濃度樣品基質(zhì)引入廢液而不引入離子源，可減少對(duì)質(zhì)譜系統(tǒng)的污染，從而提高方法的耐用性。該方法適用于對(duì)沙坦類原料藥和部分制劑中的四種亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行快速篩查和準(zhǔn)確的定量分析。