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pGBKT7-Lam Vector 酵母雙雜交對(duì)照載體

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參考價(jià):￥500 - ￥15000 /mg

具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)

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更新時(shí)間：2025-08-22 08:41:59瀏覽次數(shù)：230次

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  熒光染料

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西安強(qiáng)化生物科技有限公司

經(jīng)營(yíng)模式：生產(chǎn)廠家

商鋪產(chǎn)品：496條

所在地區(qū)：陜西西安市

聯(lián)系人：李杰（經(jīng)理）

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產(chǎn)品簡(jiǎn)介

pGBKT7-Lam Vector 酵母雙雜交對(duì)照載體，表達(dá)Lamin C與GAL4 DNA結(jié)合域的融合蛋白，含c-Myc標(biāo)簽，適用于假陽(yáng)性檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化。

詳細(xì)介紹

【??參數(shù)信息】

英文名稱：pGBKT7-Lam Vector 酵母雙雜交對(duì)照載體

載體類型：酵母雙雜交系統(tǒng)載體

載體大?。?.9kb

原核抗性：Kanamycin, Kan

克隆菌株：DH5α

載體標(biāo)簽：c-Myc

篩選標(biāo)記：TRP1

啟動(dòng)子：ADH1

表達(dá)宿主：酵母細(xì)胞

5'測(cè)序引物：T7: TAATACGACTCACTATAGGG

3'測(cè)序引物：根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物

純度：≥95%

儲(chǔ)存條件：-20℃避光干燥

生產(chǎn)廠商：西安強(qiáng)化生物科技

【簡(jiǎn)單概述】

pGBKT7-Lam是一種用于酵母雙雜交系統(tǒng)的陰性對(duì)照載體，由基礎(chǔ)載體pGBKT7改造而來(lái)。

pGBKT7-Lam Vector 酵母雙雜交對(duì)照載體其核心特征包括：

結(jié)構(gòu)組成：

表達(dá)人核纖層蛋白C（Lamin C）與GAL4 DNA結(jié)合域（DNA-BD）的融合蛋白，其中Lamin C包含66–230位氨基酸片段，DNA-BD包含1–147位氨基酸片段。

含c-Myc表位標(biāo)簽，便于融合蛋白的免疫檢測(cè)。

啟動(dòng)子系統(tǒng)：ADH1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)融合蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；T7啟動(dòng)子支持體外轉(zhuǎn)錄翻譯。

抗性標(biāo)記：原核宿主（如大腸桿菌）使用KanR，真核宿主（酵母）使用TRP1營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記。

復(fù)制原點(diǎn)：2μ ori（酵母）和pUC ori（大腸桿菌），支持雙宿主復(fù)制。

載體大?。?.9 kb（含插入片段）。

設(shè)計(jì)目的：

作為酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化陰性對(duì)照，用于檢測(cè)假陽(yáng)性相互作用背景。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

（一）載體轉(zhuǎn)化與質(zhì)粒擴(kuò)增（大腸桿菌）

感受態(tài)準(zhǔn)備：使用DH5α等克隆菌株，冰上解凍感受態(tài)細(xì)胞。

轉(zhuǎn)化：

取2μl質(zhì)粒加入100μl感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30分鐘。

42℃熱激90秒，冰浴2分鐘。

加入900μl無(wú)抗LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)45分鐘。

離心（6000 rpm, 5分鐘）后重懸菌體，涂布于含卡na霉素（50μg/ml）的LB平板。

驗(yàn)證：挑取單克隆擴(kuò)增后，通過(guò)酶切（如BamHI/PstI）或測(cè)序（引物T7 Forward）確認(rèn)載體正確性。

（二）酵母轉(zhuǎn)化（酵母雙雜交系統(tǒng)）

酵母菌株：常用Y2HGold、AH109等。

共轉(zhuǎn)化要求：

陰性對(duì)照設(shè)置：需與pGADT7-T（或空pGADT7）共轉(zhuǎn)化，形成完整對(duì)照系統(tǒng)。

陽(yáng)性對(duì)照：pGBKT7-53 + pGADT7-T（驗(yàn)證系統(tǒng)有效性）。

轉(zhuǎn)化步驟：

制備酵母感受態(tài)細(xì)胞（如LiAc/PEG法）。

加入pGBKT7-Lam及配對(duì)載體（如pGADT7-T），冰浴30分鐘。

42℃熱激15分鐘，涂布于SD/-Trp/-Leu（DDO）平板篩選共轉(zhuǎn)化子。

（三）陰性對(duì)照驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)基篩選：

將共轉(zhuǎn)化酵母接種至四缺培養(yǎng)基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp，即QDO），添加X(jué)-α-gal（顯色劑）和3-AT（抑制弱自激活）。

預(yù)期結(jié)果：

無(wú)生長(zhǎng)（或微弱生長(zhǎng)）：表明無(wú)假陽(yáng)性相互作用。

無(wú)藍(lán)色顯色：排除報(bào)告基因（如MEL1）激活。

自激活檢測(cè)：若pGBKT7-Lam單獨(dú)轉(zhuǎn)化酵母后在QDO/X平板上生長(zhǎng)，需優(yōu)化3-AT濃度抑制自激活。

（四）結(jié)果分析與注意事項(xiàng)

假陽(yáng)性排查：若陰性對(duì)照在QDO/X/A培養(yǎng)基生長(zhǎng)，需檢查載體構(gòu)建是否污染或?qū)嶒?yàn)操作誤差。

毒性檢測(cè)：觀察酵母菌落大小，若顯著小于陽(yáng)性對(duì)照，提示融合蛋白可能有毒性。

保存：轉(zhuǎn)化成功的酵母菌株可加甘油凍存于-80℃。

【相關(guān)試劑】

DAF-FM DA (5mM in DMSO)

Sodium Nitroprusside(SNP)

S-Nitrosoglutathione(GSNO)

K599 Chemically Competent Cell

K599 Electrocompetent Cell

Ar A4 Chemically Competent Cell

Ar A4 Electrocompetent Cell

Ar Qual Chemically Competent Cell

Ar Qual Electrocompetent Cell

Ar 1193 Chemically Competent Cell

ER-TrackerTM Blue-White DPX, for live-cell imaging

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本試劑僅適用于科研實(shí)驗(yàn)，敬請(qǐng)知悉。

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