Elisa實(shí)驗(yàn)：吸光度值過高是什么原因

　　ELISA實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)吸光度值過高(比如陽性對照爆表，或者陰性背景很深)，通常意味著顯色反應(yīng)過強(qiáng)，超出了酶標(biāo)儀的檢測范圍或預(yù)期的反應(yīng)閾值。

　　這會導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線在高濃度區(qū)域變得平坦，從而影響定量的準(zhǔn)確性。以下是導(dǎo)致吸光度值過高的主要原因及相應(yīng)的解決辦法：

　　1. 樣本濃度過高(超出檢測范圍)

　　這是常見的原因之一。

　　現(xiàn)象：即使是低稀釋倍數(shù)的樣本，OD值也普遍大于2.5甚至3.0，標(biāo)準(zhǔn)曲線的高濃度點(diǎn)呈飽和狀態(tài)。

　　解決辦法：

　　預(yù)實(shí)驗(yàn)：對于未知濃度的樣本，建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定大致濃度范圍。

　　增加稀釋倍數(shù)：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用試劑盒提供的樣本稀釋液對樣本進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋(例如從1:2稀釋改為1:10或1:100)，確保OD值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間范圍。

　　注意：計(jì)算最終濃度時(shí)，記得乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

　　2. 洗板不充分(背景高)

　　如果洗板步驟未能有效去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體或鏈霉親和素，這些殘留物會催化底物顯色，導(dǎo)致整個(gè)孔(包括陰性對照和空白孔)的背景信號升高。

　　現(xiàn)象：空白孔(Blank)或陰性對照孔的OD值明顯偏高(例如大于0.1)，整個(gè)板子看起來顏色都很深。

　　解決辦法：

　　增加洗滌次數(shù)：嚴(yán)格按照說明書要求的次數(shù)洗滌，建議至少洗板5次。如果背景高，可酌情增加至7次。

　　確保洗滌液注滿：每孔必須注滿洗滌液(通常300-350µL)，不能只加一點(diǎn)點(diǎn)。

　　充分浸泡：每次洗滌后，讓洗滌液在孔內(nèi)停留30-60秒，以充分解離非特異性結(jié)合。

　　拍干：洗滌后，務(wù)必將板子在厚的吸水紙上用力拍干，確保孔內(nèi)無殘留液體。如果有自動洗板機(jī)，請檢查吸液針和注液針是否堵塞。

　　3. 孵育條件不當(dāng)(反應(yīng)過度)

　　孵育溫度過高或時(shí)間過長，會加速酶促反應(yīng)，導(dǎo)致顯色過深。

　　現(xiàn)象：顯色很快，剛加入底物沒多久就變成深藍(lán)色，或者還沒加終止液顏色就已經(jīng)很深。

　　解決辦法：

　　控制溫度：確保孵育溫度恒定在37℃(或說明書要求的溫度)。避免將培養(yǎng)箱溫度設(shè)得過高。

　　精準(zhǔn)計(jì)時(shí)：每一步孵育都使用計(jì)時(shí)器嚴(yán)格計(jì)時(shí)，不要憑感覺。特別是底物(TMB)的孵育時(shí)間，通常需要避光精確控制。

　　避免堆疊：不要將兩塊板疊在一起孵育，這會導(dǎo)致下面的板受熱不均、溫度過高。

　　4. 試劑問題

　　濃縮洗滌液結(jié)晶：如果洗滌液在低溫下儲存產(chǎn)生了鹽結(jié)晶，而未充分溶解就使用，可能導(dǎo)致洗滌液濃度不準(zhǔn)，無法有效去除雜質(zhì)。

　　解決辦法：使用前若發(fā)現(xiàn)洗滌液有結(jié)晶，需將其置于37℃水浴中振搖溶解，溶解后再稀釋使用。

　　酶結(jié)合物濃度過高或失活后復(fù)活：雖然失活通常導(dǎo)致信號低，但如果濃縮液配置錯(cuò)誤，也可能導(dǎo)致濃度偏高。

　　5. 顯色時(shí)間過長

　　TMB底物顯色是動力學(xué)反應(yīng)，時(shí)間越長顏色越深。

　　現(xiàn)象：剛加入TMB不久，所有孔都開始快速變藍(lán)。

　　解決辦法：

　　避光孵育：TMB底物需要避光保存和孵育，光線會加速其非特異性反應(yīng)。

　　觀察顏色：在加入TMB后，可以觀察標(biāo)準(zhǔn)品的高濃度孔。當(dāng)其呈現(xiàn)深藍(lán)色(通常梯度明顯時(shí))，即可立即加入終止液，不一定非要等到說明書規(guī)定的最長時(shí)間。

　　立即終止：到達(dá)規(guī)定時(shí)間后，應(yīng)立即加入終止液(通常是2M H?SO?)，加入后顏色會由藍(lán)變黃。終止后需在15-30分鐘內(nèi)完成讀數(shù)，時(shí)間過長顏色會逐漸淬滅或變渾濁。

　　6. 樣本干擾(溶血或脂血)

　　樣本本身的特性有時(shí)會干擾檢測。

　　溶血：紅細(xì)胞破裂釋放的血紅蛋白具有類似過氧化物酶的活性，可以直接催化TMB顯色，導(dǎo)致假陽性或讀數(shù)偏高。

　　解決辦法：盡量不使用溶血樣本。采血時(shí)輕柔操作，避免劇烈震蕩，分離血清時(shí)吸凈紅細(xì)胞。

　　微生物污染：樣本或試劑被細(xì)菌污染，細(xì)菌的代謝產(chǎn)物(如內(nèi)源性過氧化物酶)也會導(dǎo)致背景升高。

　　7. 酶標(biāo)儀設(shè)置問題

　　波長錯(cuò)誤：使用了錯(cuò)誤的檢測波長(例如用了630nm校正波長，卻只讀取了450nm的主波長，而沒有減去背景)。

　　解決辦法：核對儀器設(shè)置，確保檢測波長正確(如450nm)，如果設(shè)置了參比波長(如630nm)，確保兩者配合無誤。

　　注：以上僅供參考，本試劑僅供科研使用，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。

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