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當(dāng)?shù)玫搅税袠?biāo)固定以及加入飽和度統(tǒng)一為50％的各個(gè)噬菌體的條件以后，我們將測定每個(gè)噬菌體對靶標(biāo)蛋白的相對結(jié)合親和性。

噬菌體結(jié)合性檢測
[器材和試劑]
● 8通道P10型移液槍（Eppendorf）
● TMB顯色液
● 96孔板（NLIncMaxisorp）
● CBB緩沖液
[方法]
1．用靶標(biāo)蛋白以實(shí)驗(yàn)方案5．2中優(yōu)化后的包被濃度包被Maxisorp微孔板的第1～11道，將第12道保留為空，以作為對照來測定噬菌體非特異性的結(jié)合。包被完成后，進(jìn)行封閉，然后洗滌整個(gè)微孔板。
2．在小管中用CBB將靶標(biāo)蛋白做10次兩倍梯度稀釋。調(diào)整濃度，使得靶標(biāo)濃度1．11倍高于檢測中所需的終濃度。注意在每次移液的時(shí)候都要換槍頭，以免殘液引起誤差。
3．將濃度zui高的靶標(biāo)溶液加入到塑料加樣槽中，吸取90gl加入被靶標(biāo)包被過的微孔板的第1道中。更換新的加樣槽，重復(fù)前面的過程，將剩下的各個(gè)稀釋液分別加入到第2～10道中。用同樣的方法，在作為對照的第11～12道中則只是加入90ul CBB溶液。
4．每個(gè)噬菌體樣品都準(zhǔn)備150ul，濃度為10倍高于得到50％飽和的結(jié)合所需的濃度。將這些溶液分別加入到另一個(gè)聚丙烯微孔板（或F型，非黏性的微孔板）上的一道中。除了不同的噬菌體變異體，還要確定包含有野生型的噬菌體。
5．用P10型移液槍，將各噬菌體樣品以從第12道到第1道的順序，分別加入10u1到每一道中（例如按競爭劑濃度由低到高的順序移動）。在微型振蕩器上將各樣品充分混勻，將微孔板蓋好，室溫下放置60分鐘。
6．吸去微孔板內(nèi)溶液，洗滌12次。
7．加入用CBB稀釋2000倍后HRP聯(lián)結(jié)的抗M13抗體，每孔100ul，在室溫下反應(yīng)20分鐘。吸去板內(nèi)液體，洗滌8次，倒出并控干洗滌緩沖液。
8．加入100/11 TMB顯色液（預(yù)先在室溫下平衡），在微型振蕩器上避光充分振蕩10分鐘。
9．立即加入100ul 2mol/L的硫酸溶液終止顯色反應(yīng)，充分振蕩30秒后用酶標(biāo)儀讀取45Onm處（A450）的吸光度值。

常常有必要先做一個(gè)初步的檢測以測定一個(gè)*濃度，并從這個(gè)濃度開始做梯度稀釋，以得到一個(gè)完整的置換曲線（displacement curve）。還應(yīng)該做一些調(diào)整，使較高濃度的競爭劑能將噬菌體的結(jié)合降低到接近非特異性結(jié)合的水平（第12道）；類似地，較低濃度的競爭劑應(yīng)該使噬菌體的結(jié)合接近無競爭劑的對照中的水平（第11道）。上述實(shí)驗(yàn)方案使用相同的競爭劑溶液，盡量減小稀釋誤差對相對親和性測定的影響。但是如果不同噬菌體變異體之間親和性相差過大時(shí)，可以在接近與ECso相對應(yīng)的濃度之前，通過做出各自的與梯度稀釋的數(shù)量大致相同的、適合的稀釋系列，以得到更高的性。