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1．包被高結(jié)合性的微孔板，一個孔用于陽性篩選（加入酶），一個孔作為本底（不加入 酶）。如果使用的文庫很大（大于109個不同的克?。?輪篩選中就要包被更多 的孔（或者更大的孔，隨后過程中溶液的體積也要相應(yīng)加大），這樣才能結(jié)合更多的噬菌體，保證克隆的多樣性。粗略估計，96孔板的一個孔能夠結(jié)合109個噬菌粒，并且在*輪篩選中zui少要能夠結(jié)合10倍于文庫中克隆數(shù)量的噬菌粒。當隨后幾輪中文庫的多樣性隨著篩選的進行而降低時，這樣的一個陽性對照孔應(yīng)該是足夠的。
2．棄去包被液、封板、洗滌，然后控干。
3．在每孔中加入10’’cfu溶解于PBST中的底物噬菌粒。室溫反應(yīng)2小時。然后洗板。
4．用蛋白酶反應(yīng)緩沖液洗板。在酶陽性篩選孔中加入100/1l溶解于反應(yīng)緩沖液的蛋白酶，在本底孔中僅加入100fAl緩沖液。室溫反應(yīng)10分鐘（或優(yōu)化后的反應(yīng)時間）并溫和搖動。
5．將蛋白酶洗脫下來的噬菌粒以及本底的噬菌粒溶液移入離心管中。
6．蛋白酶敏感的噬菌粒的擴增：對于蛋白酶酶切處理的樣品， 留下一部分（約25ul）用于滴度測定，其余的用于擴增噬菌體，繼續(xù)下一輪的篩選。
7．蛋白酶抗性噬菌粒的擴增： 用PBST洗板3次，在每孔中加入100u1 0．2m01/L、pH2．0的甘氨酸溶液，反應(yīng)5分鐘并溫和搖動。
8．將甘氨酸溶液洗脫下來的噬菌粒移入離心管，并加入10ul 1mol/L Tris堿以中和其酸性。
9．甘氨酸溶液洗脫得到的樣品也可以使用如步驟6所述的用于蛋白酶敏感性噬菌粒的方法擴增，繼而通過另外一個單獨的篩選繼續(xù)測定其抗性。如果要進一步測定其抗性，那么應(yīng)該在接下來的篩選過程中增加蛋白酶的濃度并且（或）增加反應(yīng)時間，從而篩選出對蛋白酶更具抗性的序列。
10．噬菌粒滴度測定：用感染F’大腸桿菌的方法，對初始的噬菌粒、蛋白酶酶切作用下洗脫的噬菌粒以及甘氨酸洗脫的噬菌粒樣品進行滴度測定。
11．在接下來的日子里，制備富集的噬菌粒，并重復(fù)篩選過程。通常會使用本底（不加入蛋白酶）來監(jiān)控篩選過程中的富集。
12．滴度測定的結(jié)果分析：如果篩選的能力很強，陽性的富集度[（蛋白酶酶切作用下洗脫的cfu）/（沒有蛋白酶酶切作用下洗脫的c{u）>1）可以在2～3輪篩選后得到。每輪中隨機挑選約20個克隆進行測序來看富集是否已經(jīng)達到極限。如果找到了一些序列相同 （同源序列）的克隆，那么篩選就完成了或者可以說是接近完成了，再繼續(xù)進一步的篩選過程就沒有多大意義了。從另外一個不同的，但序列相關(guān)的肽文庫中而不是繼續(xù)從已篩選出一個舉克隆的文庫中繼續(xù)篩選，可能會讓我們得到更多的信息。在任何時候，如果所有已結(jié)合的噬菌粒能夠以一個很高的比例（>50％）被切割，那么應(yīng)該通過降低蛋白酶的濃度來增加選擇壓力。雖然通過測定噬菌體滴度來監(jiān)控富集度可以有效地分析底物篩選的過程，但這可能得出各種各樣的結(jié)果，也不應(yīng)該把它視為檢測序列收斂的替代方法。事實上，即使在篩選的過程中未能看到噬菌體的顯著富集，序列也能夠在篩選的過程中趨于一致。