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1．在微孔板的兩列中加入ug/ml溶于固定緩沖液的捕獲試劑以包被微孔板，于4℃過夜或者室溫反應(yīng)2小時。
2．棄去包被溶液，在每孔中加入200ul脫脂牛奶/PBS封板。 室溫反應(yīng)2小時并溫和搖動。
3．用PBST洗板3次，將微孔板倒扣在吸水紙上拍干。每孔加入PBST溶解的100ul噬菌粒（1012cfu/m1）： 陽性對照加于*列， 陰性對照加于第二列。室溫反應(yīng)2小時并溫和搖動。
4．反應(yīng)期間，在另外一塊非結(jié)合性微孔板的一列中，制備3倍梯度的蛋白酶系列稀釋液（一般為所需的zui終濃度的5倍）。將zui后一個孔留作空白對照（只加入緩沖液）。通常將在典型的底物水解顯色法（chromogenic substratehydrolysis assay）中所用濃度的10～100倍的濃度作為合理的zui終濃度。例如，如果一個蛋白酶對于P8fr生對照底物的kcat/Km值為lO5L/（mol·s），那么zui多能夠使用50nmol/L作為合理的zui終濃度。
5．棄去噬菌粒溶液，用PBST洗滌4次。zui后一次PBST留在板內(nèi)，反應(yīng)5分鐘，其間溫和搖動。之后再以PBST洗滌4次。
6．用蛋白酶反應(yīng)緩沖液洗滌4次，之后在每孔中加入80ul的反應(yīng)緩沖液。再在微孔板的兩列中加入步驟4中提到的蛋白酶稀釋液。室溫反應(yīng)10分鐘，溫和搖動。
7．將在蛋白酶酶切作用下洗脫下來的噬菌粒溶液移入另外兩塊非結(jié)合性微孔板的*列（一個加入陽性對照，一個加入陰性對照）。這些微孔將用于噬菌粒樣品cfu滴度的測定（見下面的步驟10）。
8．用PBST洗滌結(jié)合板孔4次，在每孔中加入100ul 0．2mol/L、pH 2．0的甘氨酸溶液。室溫反應(yīng)5分鐘。
9．將被甘氨酸溶液洗脫下來的噬菌粒溶液移入上述的另外兩塊非結(jié)合性微孔板的一列中，在每孔中加入10ul 1mol/LTris堿以中和酸性。
10．制備來自步驟7和9的噬菌粒溶液的10倍系列梯度稀釋液（在非結(jié)合性微孔板上進(jìn)行），利用感染F，大腸桿菌的方法測定cfu滴度。
11．計算出每個樣品中洗脫下來的噬菌粒的濃度，并確定一個合適的底物噬菌粒文庫篩選的酶反應(yīng)濃度。理論上，陽性對照和陰性對照的洗脫液會有很大的不同。有時偏向于選擇只能切割一部分（<50％）的所有結(jié)合了的陽性對照噬菌粒的酶濃度，這樣可以保證實驗的特異性。選擇一個陽性對照中的富集度至少是陰性對照中的10倍的濃度，這樣，陰性對照中的富集就可以被忽略，而且所有結(jié)合了的噬菌粒大部分仍沒有被切割。噬菌粒的切割程度也可以通過在一個固定的酶反應(yīng)濃度下改變反應(yīng)時間的方法來進(jìn)行優(yōu)化。然而，與改變酶濃度相比，通過改變時間來覆蓋更廣范圍的總酶活是更加困難的。另外，相對于親和標(biāo)簽與捕獲分子的解離速度，反應(yīng)時間應(yīng)該較短，這一點是很重要的。