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將循環(huán)PCR的產(chǎn)物作為誘變寡聚核苷酸，通過(guò)黏末端定向的突變，讓其與一個(gè)編碼去穩(wěn)定化蛋白（在泛素案例中為pCANTAB B—AL7）的單鏈DNA（ssDNA）模板退火。在這一步，雙鏈的引物先被降解，然后在DNA模板和Tag聚合酶存在的情況下溫度緩慢降低，使引物能與模板退火并延伸。這一步提高了延伸的引物和模板ssDNA之間的互補(bǔ)性，從而合適的循環(huán)PCR產(chǎn)物鏈應(yīng)優(yōu)先與ssDNA模板，而不是與合成的互補(bǔ)的寡核苷酸鏈相結(jié)合。退火后，為了完成突變，接下來(lái)進(jìn)行一個(gè)與Kunkel所述相類似的步驟。

黏末端定向的突變生成隨機(jī)化文庫(kù)
[器材和試劑]
● lmol/LTris—HCl緩沖液，pH 8．0
● 0．2mol/L MgCl2
● 0．1m01/L DTT （dithiothreit01， 二硫蘇糖醇）
● 10mm01/L ATP （New England Biolabs）
● 10×PCR緩沖液： 0．1mol/L Tris—HCl緩沖液，0．5m01/L KCl， 15 mm01/L MgCl2，pH 8．3
● 10×T7聚合酶緩沖液：0．4mol/L Tris HCl緩沖液，0．321TIOl/L NaCl，0．2mol/L MgCl2， 50mmol/LDTT
● G、 A、 T、 C各含25 mm01/L的dNTP（New England Bi01abs）
● T4多聚核苷酸激酶（NewEnglandBiolabs）
● T4DNA連接酶（NewEnglandBlOlabs）
● T7 DNA聚合酶（New England Biolabs）
● Tag DNA聚合酶（Promega）
● 0．5m01/L EDTA
● 超純水
● PCR儀
● 礦物油
● 循環(huán)PCR膠回收產(chǎn)物
● 為突變過(guò)程制備含尿嘧啶的單鏈DNA（dU—ssDNA）模板所需的試劑及儀器
● 編碼去穩(wěn)定化蛋白變異體的噬菌體展示載體DNA（如泛素案例中的pCANTAB B—AL7）
[方法]
1．制備編碼去穩(wěn)定化蛋白質(zhì)變異體的噬菌體展示載體的dU—ssD—NA模板。使用制備于大腸桿菌dut ung型菌株（如CJ236）的含有尿嘧啶的模板，通過(guò)將退火產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入dut+ung+型菌株中，使得針對(duì)模板鏈的篩選能夠進(jìn)行。
2．建立如下的反應(yīng)體系，并在37℃反應(yīng)45分鐘，然后在65℃反應(yīng)10分鐘，使雙鏈的誘變引物磷酸化。
● H20，將總體積補(bǔ)足20ul的量
● 循環(huán)PCR產(chǎn)物，使終濃度為6pmol/ul的量
● 1mol/LTris—HCl緩沖液，pH 8.0，2ul
● 0．2m01/LMgCl2，1ul
● 0．1mol/LDTT，1ul
● 10 mm01/LATP，1.3ul
● T4多聚核苷酸激酶，0.5ul
3．在如下反應(yīng)體系中，將磷酸化的誘變引物（得自步驟2）和ssDNA模板（得自步驟1）退火。調(diào)節(jié)磷酸化引物和ssDNA的濃度使得引物過(guò)量（我們通常使用過(guò)量25倍的物質(zhì)的量），這一點(diǎn)是很重要的。
● H20，將總體積補(bǔ)足20ul的量
● 10X PCR緩沖液，1ul
● dNTP， 0．5ul
● 從步驟1得到的ssDNA模板，終濃度為0．24pmol/ml在PCR儀中，將礦物油下的反應(yīng)體系在92℃加熱2分鐘，使DNA變性。然后讓反應(yīng)體系在67℃反應(yīng)30秒，再在37℃反應(yīng)1分鐘，每個(gè)步驟之間改變溫度的時(shí)間為2分鐘。
● 從步驟2得到的磷酸化模板，1ul
● TagDNA聚合酶（5U～1），0．5ul
4．在退火過(guò)程中，準(zhǔn)備如下用于延伸/連接反應(yīng)的混合物，并于冰上保存。
● H20，5．5ul
● 10×T7聚合酶緩沖液，1ul
● 5mm01/LATP， 1ul
● 0，lm01/LDTT， 1ul
● T4DNA連接酶（400U/ul），1ul
● T7DNA聚合酶（10U/ul），0．5ul
5．退火步驟之后，立刻將該混合物加入到步驟3所得的模板/引物混合物中。