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穩(wěn)定折疊的泛素變異體的蛋白酶篩選
可以使用一系列針對(duì)不同蛋白序列特征而具有不同特異性的蛋白酶，來進(jìn)行蛋白酶篩選實(shí)驗(yàn)。除了據(jù)報(bào)道能切割pⅢ蛋白的枯草桿菌蛋白酶（subtilisin），絲狀噬菌體通常能抵抗大部分位點(diǎn)特異性的蛋白酶。在我們的實(shí)驗(yàn)中，用糜蛋白酶（chymotrypsin）或胰蛋白酶（trypsin），來處理通過其N端的組氨酸標(biāo)簽而被固定在固體基質(zhì)上的展示了蛋白的噬菌體。已有兩種不同的鎳衍生的基質(zhì)可供使用：用于Biacore設(shè)備的鎳衍生傳感器芯片（Biacore AB）及自成體系的Ni-NTA瓊脂糖珠（Qiagen）。我們發(fā)現(xiàn)，表面等離子體共振技術(shù)（sgrfaceplasmonresonance，SPR）可以快速而直接地對(duì)結(jié)合及蛋白酶解的步驟，以及在篩選前和篩選后對(duì)單克隆或噬菌體群落的鑒定，實(shí)現(xiàn)可視化并監(jiān)測。相比之下，由于需要大量洗滌及洗脫，Ni-NTA固定化技術(shù)則是更加費(fèi)力及費(fèi)時(shí)的。然而，可分級(jí)性（scalability）和更大的結(jié)合容量意味著Ni-NTA瓊脂糖珠自己就很適用于篩選。

在Biacore設(shè)備上用SPR對(duì)單克隆及噬菌體群落的篩選
SPR技術(shù)對(duì)于實(shí)時(shí)監(jiān)測生物分子的間相互作用是很有用的。這種方法通過檢測溶液在特定接面上的折光率的變化來起作用，而這些變化伴有發(fā)生在這些表面上的結(jié)合事件。典型地，如一個(gè)反應(yīng)物被固定在微型流通池（micro-flowcell）表面，而含有其他反應(yīng)物的樣品被加入到系統(tǒng)中。以一個(gè)SPR信號(hào)[單位為RU（resonance unit，共振單位）]的形式，結(jié)合及隨后的分離事件被檢測出來。使用Biacore設(shè)備，1000 RU一般接近于每平方毫米芯片表面結(jié)合lng的物質(zhì)。RU值的隨著時(shí)間的變化，將會(huì)以感應(yīng)圖（sensogram）的形式，給出在傳感器芯片表面上發(fā)生的相互反應(yīng)的記錄。

使用Ni-NTA瓊脂糖珠的蛋白酶篩選
由于Biacore設(shè)備中可用的狹小表面面積會(huì)造成種種限制，我們使用結(jié)合容量不是如此有限的NlNTA瓊脂糖珠來進(jìn)行蛋白酶篩選。僅僅通過增加用于結(jié)合與篩選的NlNTA瓊脂糖珠的用量，就可以保證對(duì)文庫容量較大的文庫的篩選。為了包含大約4×105個(gè)變異體及其20倍重復(fù)的泛素噬菌體文庫，我們目前使用NlNTA瓊脂糖珠進(jìn)行的篩選已經(jīng)得到了優(yōu)化。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)方案中，蛋白酶解、洗滌和洗脫的條件，都是經(jīng)驗(yàn)性地確定自我們對(duì)泛素的篩選工作，并且對(duì)于不同蛋白質(zhì)*參數(shù)也有所不同。根據(jù)制造商提供的資料，1m1NlNTA瓊脂糖珠足夠用于結(jié)合5～10mg分子質(zhì)量平均為20kDa的組氨酸標(biāo)記的蛋白。在此基礎(chǔ)上，1 m1珠子應(yīng)該具有大約1014個(gè)噬菌體（分子量大約為1．5X107）的結(jié)合容量。
通常，我們通過3～4輪的蛋白酶篩選來增殖噬菌體?？梢允褂猛瑯拥臈l件，也可以改變這些條件，來進(jìn)行連續(xù)的幾輪篩選。舉例而言，如果篩選目的是選出超級(jí)穩(wěn)定的變異體，可以在連續(xù)的幾輪篩選中增加篩選的壓力，比如通過逐步增加變性劑、升高溫度或用別的方式改變篩選條件。另外，對(duì)于目的在于探索序列與結(jié)構(gòu)/穩(wěn)定性之間微妙而特殊的的實(shí)驗(yàn)，可以用較小的選擇壓力進(jìn)行蛋白酶篩選，以繁殖大量的克隆來為序列分析提供數(shù)據(jù)。

篩選出的克隆的鑒定
為了對(duì)篩選出的克隆進(jìn)行zui初的鑒定，可以對(duì)來自各個(gè)噬菌體的DNA進(jìn)行測序，以使用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方案鑒定被展示的蛋白。使用pCANTAB B或類似的載體，由于這種載體在目標(biāo)蛋白和pⅢ蛋白之間含有兩個(gè)可抑制的琥珀終止密碼子（TAG），通過轉(zhuǎn)移到一個(gè)非抑制性的大腸桿菌菌株如HB2151，篩選出的蛋白能很容易地被表達(dá)，并從pⅢ蛋白上游離出來。因?yàn)榻M氨酸標(biāo)簽連在目的蛋白的N端，使用標(biāo)準(zhǔn)的Ni-NTA瓊脂糖珠法，可以簡單地實(shí)現(xiàn)對(duì)得到的蛋白的純化。在我們的泛素實(shí)驗(yàn)中，我們接著使用圓二色性（circulardichroism，CD）和核磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）光譜學(xué)來顯示：篩選出的克隆是*折疊的，與野生型蛋白有著相似的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。