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在過去的幾年里，利用cDNA合成和克隆工具，傳統(tǒng)eDNA文庫的制備大大被簡化了。由于這些工具的出色操作使得eDNA文庫的重建比較簡單，這些過程不在這里討論。然而，有一個(gè)過程將被詳細(xì)介紹，那就是從一個(gè)已制備好的eDNA文庫中獲得eDNA片段。首先用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對(duì)它進(jìn)行擴(kuò)增，隨后將它轉(zhuǎn)移到gⅥ噬菌粒表達(dá)載體中。

1 ．利用PCR從預(yù)制的丸GTll文庫中制備cDNA插入片段：pG6質(zhì)粒是為帶有多聚T核苷酸的cDNA進(jìn)行方向性克隆而設(shè)計(jì)的。利用帶有各自閱讀框的三個(gè)載體，每個(gè)cDNA都有可能被正確翻譯，直到核糖體遇到終止密碼子?？紤]到許多蛋白分子的裝配，采用隨機(jī)引物法來構(gòu)建cDNA文庫可能對(duì)克隆相互作用更適合。事實(shí)上，不是全長蛋白而是功能區(qū)，特別是細(xì)胞質(zhì)的功能區(qū)對(duì)無毒性的及作為pⅥ融合的表達(dá)起著更重要的作用。然而，在理想條件下，在這些載體中對(duì)用隨機(jī)引物法構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行克隆必須要求在每個(gè)載體的N021位點(diǎn)后，在每個(gè)閱讀框內(nèi)有翻譯終止子的引導(dǎo)區(qū)。而且，只有50%的轉(zhuǎn)化子在正確的表達(dá)位點(diǎn)上包含了cDNA片段。

利用PCR從已制備的cDNA文庫中制備大量的cDNA片段，用來構(gòu)建gⅥ-cDNA噬菌體顆粒文庫。盡管描述了從一個(gè)已制備的、SfiI-NotIλ入GTll方向性克隆的cDNA文庫中擴(kuò)增的cDNA片段，但是這更適合于從使用適當(dāng)載體引物的其他文庫中擴(kuò)增cDNA片段，這個(gè)引物包含了酶SfiI和酶NotI的限制位點(diǎn)。建立一個(gè)大容量的gⅥ-cDNA文庫需要有十個(gè)同一的PCR反應(yīng)。盡管提供一個(gè)特殊的方法很難，但從經(jīng)驗(yàn)上來說，哺乳動(dòng)物的cDNA文庫由5×105～1×106個(gè)獨(dú)立的克隆組成，從系統(tǒng)學(xué)上說，這些克隆至少包含每個(gè)mRNA的一個(gè)拷貝。模板cDNA文庫應(yīng)該如實(shí)地把序列、序列大小以及產(chǎn)生它的mRNA數(shù)量的復(fù)雜程度呈現(xiàn)出來，這是很重要的一面。為了增加DNA合成的保真度，我們推薦使用具有3’到5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。

擴(kuò)增的DNA純化后，用Sfi和NotI進(jìn)行消化，除去小片段的cDNA，用0．8%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳來分離消化的cDNA片段。另一方面，這些短的片段選擇性地插入到文庫中，并減少文庫中長cDNA克隆基因的數(shù)量。從瓊脂糖薄片上純化DNA并借用商業(yè)可行的系統(tǒng)可以恢復(fù)和濃縮靶cDNA（大小在500～3000bp）。

2．連接與轉(zhuǎn)化：擴(kuò)增的cDNA片段連接到pG6質(zhì)粒上，為了確定優(yōu)化條件，在腳注中描述了連接測(cè)試。另外，為了增加轉(zhuǎn)化效率，建議純化連接混合物。近年來，電轉(zhuǎn)化法是將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中zui有效的方法。

3．gⅥ-cDNA文庫的評(píng)價(jià)及保存
為了確保在eDNA文庫重建過程中篩選出來的陰性結(jié)果不是由技術(shù)失誤造成的，因此檢驗(yàn)文庫的質(zhì)量是十分有必要的，建議要決定好獨(dú)立文庫克隆的數(shù)量、片段基因克隆的比例、片段平均長度及它的長度范圍。更加嚴(yán)格的質(zhì)量控制的方法是隨機(jī)抽取10個(gè)克隆，對(duì)每個(gè)cDNA片段從5’端至3’端測(cè)序，然后利用BLASTN數(shù)據(jù)庫來分析獲得的序列。