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谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白純化常見問題指南
發(fā)布時(shí)間：2017-7-21谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）是一個(gè)含有211個(gè)氨基酸的蛋白，通常將該蛋白加入到重組蛋白的末端以便對(duì)該重組蛋白進(jìn)行純化或檢測。具有組氨酸的非融合蛋白會(huì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合，這會(huì)阻礙組氨酸標(biāo)簽的親和純化。但GST標(biāo)簽則與之不同。由于GST對(duì)于其底物-谷胱甘肽具有*的特異性，所以可以獲得更高的純度。
另外，GST標(biāo)簽蛋白含有特殊的剪切序列，純化后使用不同的蛋白酶即可簡單的去掉GST標(biāo)簽。同時(shí)，GST標(biāo)簽蛋白的純化在非常溫和的條件下進(jìn)行，可有效保護(hù)靶蛋白的功能和抗原性。
但是，在GST融合蛋白純化中，經(jīng)常會(huì)遇到一些問題。本專題對(duì)這些問題進(jìn)行了匯總，指出了大多數(shù)純化方法存在的普遍問題，對(duì)于特別的純化方法的問題也有提，形成了GST融合蛋白純化常見問題指南。
問題一：目的蛋白與磁珠不結(jié)合或結(jié)合效率低
可能原因：目的蛋白與磁珠不結(jié)合或結(jié)合效率低
解決辦法：測序確認(rèn)，調(diào)整閱讀框以獲得GST.Tag融合表達(dá)蛋白；使用蛋白酶缺陷型大腸桿菌作為表達(dá)宿主菌；如果有稀有密碼子應(yīng)采用Rosetta系列宿主菌。
可能原因：GST 融合蛋白被機(jī)械裂解的方法變性（比如超聲）
解決辦法：過度超聲會(huì)破壞標(biāo)簽蛋白而減少其與磁珠的結(jié)合；在裂解過程中，用溫和的機(jī)械/化學(xué)裂解條件，裂解的條件必須依照經(jīng)驗(yàn)來決定。
可能原因：GST 融合蛋白在樣品中有聚集，導(dǎo)致沉淀
解決辦法：在細(xì)胞裂解前加入DTT，在緩沖液中也加入DTT 。1-20mM的DTT 會(huì)顯著增加某些GST融合蛋白的結(jié)合。
可能原因：GST融合蛋白的濃度過低
解決辦法：濃縮樣品。結(jié)合能力具有濃度依賴性。低表達(dá)量的蛋白可能不會(huì)像高表達(dá)量蛋白那樣有效地結(jié)合磁珠。因此，濃縮樣品會(huì)提高結(jié)合。
可能原因：標(biāo)簽蛋白可能改變了GST 的構(gòu)象，因此降低了GST 標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力。
解決辦法：檢測所使用的pGEX 載體中GST的結(jié)合。準(zhǔn)備帶有所使用的pGEX的細(xì)胞超聲裂解物，檢測其與磁珠的結(jié)合。如果結(jié)合的很好，則可能是標(biāo)簽蛋白改變了GST 的構(gòu)象，因此降低了GST 標(biāo)簽蛋白的親和力?？梢酝ㄟ^降低結(jié)合的溫度到4°C限制洗滌來改善結(jié)果。
可能原因：結(jié)合條件不佳
解決辦法：低于pH6.5或高于pH8時(shí)，融合蛋白與磁珠結(jié)合不充分導(dǎo)致結(jié)合效率低，請確認(rèn)磁珠在用于目的蛋白純化前經(jīng)過pH6.5~8.0緩沖液充分的平衡。
可能原因：磁珠使用次數(shù)過多
解決辦法：如果已使用幾次，應(yīng)考慮磁珠再生或使用新的磁珠。
問題二：目的蛋白不能洗脫或洗脫效率低
可能原因：洗脫緩沖液的體積太少
解決辦法：增加洗脫緩沖液的體積。
可能原因：洗脫的時(shí)間不夠
解決辦法：增加洗脫緩沖液與磁珠反應(yīng)的時(shí)間。
可能原因：洗脫緩沖液中谷胱甘肽濃度太低
解決辦法：增加洗脫緩沖液中谷胱甘肽的濃度：本方案中建議的10mM 濃度對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用來說足夠了，但是也存在例外。嘗試使用50mM Tris-HCl，20-40mM 還原型谷胱甘肽，pH8.0 作為洗脫緩沖液。
可能原因：洗脫緩沖液的pH過低
解決辦法：增加洗脫緩沖液的pH值：將pH增加到8-9 會(huì)增強(qiáng)洗脫而不用提高洗脫所用谷胱甘肽的濃度。
可能原因：洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度過低
解決辦法：增加洗脫緩沖液中的離子強(qiáng)度，在洗脫緩沖液中加入0.1~0.2M的氯化鈉也會(huì)改善洗脫效果。
可能原因：洗脫緩沖液中的谷胱甘肽被氧化了
解決辦法：使用新鮮配制的洗脫緩沖液。
問題三：洗脫的蛋白中有雜質(zhì)
可能原因：GST融合蛋白被蛋白酶部分降解
解決辦法：加入蛋白酶抑制劑。出現(xiàn)多條帶可能是由于目的蛋白被蛋白酶部分降解的結(jié)果?？稍诹呀馊芤褐屑尤?/span>1mM PMSF防止目的蛋白降解。一種無毒的水溶性的PMSF替代物是AEBSF，Roche Biochemicals的商品名為Pefabloc SC 。注：絲氨酸蛋白酶抑制劑必須在使用凝血酶或凝血因子Xa 前除去。
可能原因：在宿主細(xì)菌中的蛋白降解
解決辦法：多條帶可能是在宿主細(xì)菌中蛋白酶切造成的。如果是這種情況，需要使用蛋白酶缺陷型菌株（比如lon-或ompT），大腸桿菌BL21 隨pGEX 載體提供，這種菌株是ompT和lon缺陷型菌株。
可能原因：細(xì)胞破碎時(shí)超聲處理過度
解決辦法：降低裂解時(shí)間，機(jī)械裂解前加入溶菌酶（0.1 倍體積的10 毫克/毫升溶菌酶溶液，溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 ）可能會(huì)使結(jié)果變好。避免發(fā)泡，因?yàn)檫@可能使標(biāo)簽蛋白變性。過分裂解也會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白和GST 標(biāo)簽蛋白共純化。
可能原因：分子伴侶可能被共純化了
解決辦法：多余的條帶可能由于共純化一些分子伴侶所造成。這些分子伴侶參與大腸桿菌中新生成的蛋白的正確折疊。如：DnaK（分子量70 000）、DnaJ（分子量37 000）、GrpE（分子量40 000）GroEL （分子量57 000）、GroES（分子量10 000 ）。一些從這些共純化的蛋白中分離GST融合蛋白的方法已經(jīng)發(fā)表。
問題四：目的蛋白酶切后電泳檢測發(fā)現(xiàn)多條條帶
可能原因：蛋白酶切發(fā)生在宿主細(xì)菌內(nèi)
解決辦法：檢測條帶何時(shí)出現(xiàn)：如果確定多余的條帶在Precission Protease，凝血酶，凝血因子Xa切割前不存在，這些條帶可能是在宿主細(xì)菌中被降解的結(jié)果。目的蛋白可能含有Precission Protease，凝血酶，凝血因子Xa 的切割位點(diǎn)，請檢查序列。