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一、目的

了解常用簡易保藏法的原理，掌握其操作方法。

二、原理

常用簡易保藏法包括斜面低溫保藏法、半固體穿刺保藏法、液體石蠟保藏法、甘油保藏法，沙上管保藏法等。由一這此保藏方法只需要特殊設(shè)備，操作簡便易行，故為一般實驗空及生產(chǎn)單位所廣泛采用。

斜面低溫保藏法和半固體穿刺保藏法是將在斜面或半固體培養(yǎng)基上己生長好的培養(yǎng)物置于4~5℃冰箱屮保藏。這兩種方法都是利用低溫抑制微生物的生長繁殖，從而延長保藏時間。

液體石蠟保藏是在新鮮的斜面培養(yǎng)物上，覆蓋一層經(jīng)過滅菌的液體石蠟，再置于4~5℃冰箱中保藏。液體石蠟主要起隔絕空氣作用，故此法是利用缺氧低溫雙重抑制微生物生長，從而延長保藏時間。

甘油保藏法是在液體的新鮮培養(yǎng)物中加入適量的經(jīng)過滅菌的甘油，然后再置于-20℃或-70℃冰箱中保藏。此法適用于甘油作為保護(hù)劑，甘油透入細(xì)胞后，能強烈降低細(xì)胞的脫水作用，同時在低溫條件下，可大大降低細(xì)胞代謝水平，達(dá)到延長保藏時間的目的。

沙土管保藏法是將待保藏菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后制成孢子懸液，將孢子懸液滴入已滅菌的沙土管中，孢子即吸附在沙子上，將沙土管置于真空干燥器中，吸干沙土管中水分，經(jīng)密封后至于-4℃冰箱中保藏。此法利用干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)、低溫等因素綜合抑制微生物生長繁殖，從而眼殘保藏時間。

三、材料

1.菌種  細(xì)菌、放線苗、酵母菌及霉菌。

2.培養(yǎng)基  肉膏蛋白胨斜面及半固體深層培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖斜面培養(yǎng)基、高氏一號斜面培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基。

3.其他  無菌液體石蠟、無菌甘油、帶螺口蓋和密封圈的無菌試管或1.5ml無菌Eppendorf管、100ml三角瓶。

四、方法與步驟

1.斜面低溫保藏法（適用于細(xì)菌、放線菌、酵母菌及霉菌的保藏〕將菌種接種在適宜的培養(yǎng)基斜面上，在適宜的溫度培養(yǎng)，使其充分生長。如果是能形成芽孢或孢子等休眠體的菌種，待形成芽孢成孢子等休眠體后再置于4~5℃冰箱中進(jìn)行保藏。

不同種類的微生物有不同的保藏期，到期后需轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，再行保藏。此法優(yōu)點是操作簡便，不需要特殊設(shè)備；缺點是保藏時間短，菌種經(jīng)反復(fù)轉(zhuǎn)接后，遺傳性狀已發(fā)生變異，生理活性減退。各類微生物的培養(yǎng)條件見表14-1。

2.半固體穿刺保藏法（適用于兼性厭氧細(xì)菌或酵母菌的保藏）用穿剌接種法將菌
種接入半固體深層培養(yǎng)基*部分，注意不要穿透底部。在適宜的溫度培養(yǎng)，使其充分生長。培養(yǎng)好的菌種置于4-5℃冰箱保藏。一般保藏0.到1a后，需轉(zhuǎn)接到新的半固體深層培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后再行保藏。

3.液體石蠟保藏法<適用于真菌和放線菌保藏）

（1）無菌液體石蠟制備  將液體石蠟罝1于100ml的三角瓶內(nèi)，毎瓶裝10ml，塞上棉塞，外包牛皮紙、高壓蒸汽滅菌（0.1Mpa30min）。滅菌后將裝有液體石蠟的三角瓶置于105~110℃的烘箱內(nèi)約1h，以除去液體石蠟中的水分。

(2)接種、培養(yǎng)及保藏  將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，在適宜的溫度下培養(yǎng)，使其充分生長。用無菌吸管吸取無菌液體石蠟，注入到已生長好菌的斜面上，液體石蠟的用量以高出斜面頂端1cm左右為準(zhǔn)，使菌種轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后加入適量滅菌液體石蠟，再行保藏。

4.甘油保藏法（常用于細(xì)菌保藏）

（1）無菌甘油制備  將甘油置于100ml的三角瓶中，每瓶裝10ml，塞上棉塞，外包牛皮紙，高壓蒸汽滅菌（0.1Mpa20min）。

⑵接種、培養(yǎng)及保藏  挑取一環(huán)菌種接入LB液體培養(yǎng)基試管中，37℃振蕩培養(yǎng)至充分生長。用吸管吸取0.85ml培養(yǎng)液，置于一只帶有螺口蓋和空氣密封圈的試管中或一支1.5ml的Eppendorf管中，再加入0.15ml無菌甘油，封口，振蕩混勻。然后將其置于乙醇-干冰或液氮中速凍。zui后將已冰凍的含有甘油的培養(yǎng)物置于-20~70℃保藏，保藏期為0.5~1a。

到期后，用接種環(huán)從凍結(jié)的表面刮去培養(yǎng)物，接種至LB斜面上，37℃培養(yǎng)48h。然后用接種環(huán)從斜面上挑取一環(huán)長好的培養(yǎng)物，置入裝油2mlLB培養(yǎng)液的試管中，再加入2ml含30%無菌甘油的LB液體培養(yǎng)基，振蕩混勻。zui后分裝于帶有螺口蓋和密封圈的無菌試管中或1.5的Eppendorf管中，按上述方法速凍保藏。

5.沙土管保藏法（適用于產(chǎn)孢子的芽孢桿菌、梭菌、放線菌和霉菌的保藏）

（1）無菌沙土管制備  取河沙若干，用40目篩子過篩，出去大的顆粒。再用10%HCL溶液浸泡2-4h除去有機(jī)雜質(zhì)，倒出鹽酸，用自來水從洗至中性，烘干。另取非耕作層瘦黃土若干，磨細(xì)，用100目篩子過篩。取1份制備的土加加4份沙混合均勻，裝入小試管中（如血清管大小）。裝量約1cm高即可，塞上棉塞，0.1Mpa滅菌1h，每天一次，連續(xù)3d。

 （2）制備菌懸液  吸取3~5ml無菌水至一支已培養(yǎng)好的菌種斜面中，用接種環(huán)輕輕攪動培養(yǎng)物，使呈菌懸液。

 （3）加樣及干燥  用無菌吸管吸取菌懸液，在毎支沙土管中滴加4~5滴菌懸液，塞上棉塞，振蕩搖勻。將已滴加菌懸液的沙土管置于預(yù)先放有五氧化二磷或無水氯化鈣的干燥器內(nèi)。當(dāng)五氧化二磷或無水氯化鈣因吸水變成糊狀時，則應(yīng)進(jìn)行更換。如此數(shù)次，沙土管即可干燥。也可用真空泵連續(xù)抽氣約3h，即可達(dá)到干燥效果。

 （4）抽樣檢查  從柚干的沙土管中，每10支抽取1支進(jìn)行檢査。用接種環(huán)取少許沙土，接種到適合于所保藏菌種生長的斜面上，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察所保藏菌種的生長及有無雜菌生長情況。

（5）保藏  檢查合格后，可采用以下方法進(jìn)行保藏：①沙土管繼續(xù)放入干燥器中，置于室溫或冰箱中。②將沙土管帶塞一端浸人熔化的石蠟中，密封管口。③在煤氣燈上，將沙土管的棉塞下端的玻璃燒熔.封住管口，再置4℃冰箱中保藏。此法可保截菌種1年到數(shù)年。

                表14-1各種微生物斜面培養(yǎng)條件及保藏期  

菌類	培養(yǎng)基名稱	培養(yǎng)溫度（℃）	培養(yǎng)時間（d）	保藏溫度（℃）	保藏時間（min）
細(xì)菌	肉膏蛋白胨斜面	30~37	1-2	4-5	1-3
放線菌	馬鈴薯葡萄糖或  高氏合成一號斜面	25~30	5-7	4-5	3-6
酵母菌	豆芽汁葡萄糖或  麥芽汁斜面	25~30	2-3	4-5	2-4
霍菌	豆芽汁葡萄糖或  麥芽汁斜面	25~30	3-5	4-5	3-6