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種子蛋白質(zhì)系統(tǒng)分析：種子蛋白質(zhì)組分分析
發(fā)布時間：2014-4-4一、目的
種子蛋白質(zhì)由10％-15％的原生質(zhì)蛋白質(zhì)（復(fù)合蛋白質(zhì)）和85％-90%的貯藏蛋白質(zhì)（簡單蛋白質(zhì)）組成。Osbome 在種子中發(fā)現(xiàn)與分離出來清蛋白、球蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白等4 個組分。不同作物種子中各蛋白組分比例有很大差異，不同蛋白組分的必需氨基酸含量也不相同，通常醇溶蛋白中缺乏Lys、Trp、Met 及Ile 等必需氨基酸，其營養(yǎng)價值zui低。因此，根據(jù)種子蛋白質(zhì)組分的相對含量，可以評判蛋白質(zhì)的品質(zhì)。通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)并掌握用連續(xù)累進(jìn)提取法分離種子蛋白質(zhì)各組分。
二、原理
根據(jù)清蛋白可溶于水、球蛋白溶于稀鹽溶液、醇溶蛋白溶于乙醇、谷蛋白可溶于稀堿或稀酸溶液的性質(zhì)，可用不同溶劑把這4 種組分從樣品中分離提取出來。然后用凱氏法分別定量或利用SDS-PAGE 進(jìn)行各組分亞基分析。
三、 儀器 、試劑和材料
1． 儀器
( 1）日本MRK 公司產(chǎn)VS - KT-P 自動定氮儀
( 2）樣品磨
( 3）玻璃層析柱
2． 試劑
( 1 ) 50％異丙醇（V / V）或70％乙醇
( 2 ) 3％硼酸
( 3 )0.5mol / L NaCI
( 4 )0.l mol / L NaOH
四、操作步驟
1．制樣
谷物籽粒風(fēng)干，用樣品磨粉碎，放干燥器中備用。
2．裝柱
在玻璃層析柱底部過濾篩板上置一層濾紙。稱取酸洗并經(jīng)540℃ 高溫處理的石英砂 60g，樣品2g 裝入三角瓶中混勻，每個樣品重復(fù)3 次，設(shè)空白對照。另稱取石英砂20g，其中10g 置于層析柱底部，將三角瓶中混合物裝入柱內(nèi)，再將剩余的10g 石英砂加入層析柱上部。裝好后用小木棒輕輕敲打把空氣排出。
3．提取
在提取前加20rnl 蒸餾 水，排出柱內(nèi)氣體，浸濕樣品，然后按下列步驟進(jìn)行。
( 1）加100ml 蒸餾 水調(diào)節(jié)流速為0.5ml / min，提取清蛋白，定容于100ml 容量瓶中。
( 2）加100ml0.5mol / L NaCI 提取球蛋白，定容于100 ml 容量瓶中。
( 3）加100ml 70％乙醇提取醇溶蛋白，定容于100ml 容量瓶中。
( 4）加100ml0.1 mol / L NaOH 提取谷蛋白，定容于100ml 容量瓶中。
4．提取液中蛋白質(zhì)含量測定
( 1）從每一容量瓶中吸取10ml 提取液放入消化管中（搖勻后再吸）。然后加3ml 濃濃硫酸，2.5g 催化劑。用150℃ 加熱0.5h 蒸干溶劑，然后用200℃消化0.5h , 400℃ 消
化0.5h。
( 2）消化管自然冷卻后，即可用自動定氮儀進(jìn)行含氮量測定。
5．樣品 總蛋白 質(zhì)含量測定
每一樣品稱取0.2g ，重復(fù)3 次，然后按本實(shí)驗(yàn)I 方法用自動定氮儀測定含氮量。
五、結(jié)果處理
( l）計算樣品中蛋白質(zhì)含量。
( 2）計算各蛋白組分在樣品中的含量及占 總蛋白 質(zhì)的比率。