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檢查試管是否干燥、潔凈，若否，則將其洗凈并置于干燥箱內(nèi)120℃烘干。

 

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

    取普通清潔試管7支，標(biāo)號(hào)，1號(hào)管為空白，2～7管用微量注射器分別加1.0mg/mL的牛血清白蛋白（即標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）溶液10，20，40，60，80，100mL。各管均用0.015mol/L PBS緩沖液補(bǔ)充到100mL（即0.1mL），詳見表6-1。混勻待用。

表13-1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

管號(hào)	標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（mL）	緩沖液（mL）	總體積（mL）
1	0	100	100
2	10	90	100
3	20	80	100
4	40	60	100
5	60	40	100
6	80	20	100
7	100	0	100

2.將待測蛋白配成合適濃度

    另取3支清潔試管，編號(hào)8、9、10，用微量注射器按表6-2操作，將待測蛋白配成系列濃度。

 

表13-2待測蛋白的稀釋

管號(hào)	待測蛋白質(zhì)（mL）	緩沖液（mL）	總體積（mL）	稀釋倍數(shù)
8	20	80	100	5
9	40	60	100	2.5
10	60	40	100	1.67

 

3.加入G250試劑

    各試管充分混勻后，用取樣器分別加入5.0mL考馬斯亮蘭G250試劑，每加完一管，立即混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。

 

4.比色

    各管室溫靜置2～5min后，在分光光度計(jì)上測定595nm處的光吸收值A ₅₉₅ ，空白對(duì)照為第1號(hào)試管，標(biāo)準(zhǔn)和待測蛋白樣同時(shí)比色。

 

    注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），只能使用玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇潤洗，洗去顏色。

                          

5.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

    以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）為橫座標(biāo)、吸光度值A ₅₉₅ 為縱座標(biāo)作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

6.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測蛋白濃度

    在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，根據(jù)測出的待測樣品的A ₅₉₅ 值，查出試管中蛋白質(zhì)濃度，再按照計(jì)算公式：

待測蛋白質(zhì)的濃度（mg/mL）＝查出的濃度×稀釋倍數(shù)

    計(jì)算出待測蛋白濃度。如樣品稀釋合理且操作得當(dāng)，待測蛋白的三個(gè)數(shù)值應(yīng)具有同一性，取其平均值作為待測蛋白濃度。如某一光吸收值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍外，舍棄該點(diǎn)。

　

計(jì)算

管號(hào)		標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（mL ）	緩沖液（mL ）	G-250試劑（mL）	每管中的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）	光吸收值（A 595 ）
標(biāo) 準(zhǔn) 蛋 白	1	0	100	5	0
	2	10	90	5	0.1
	3	20	80	5	0.2
	4	40	60	5	0.4
	5	60	40	5	0.6
	6	80	20	5	0.8
	7	100	0	5	1.0

 

 

管號(hào)		待測蛋白質(zhì)（mL ）	緩沖液（mL ）	G250試劑（mL）	A 595	查出的濃度（mg/mL）	稀釋倍數(shù)	待測蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）
待測蛋白	8	20	80	5			5
	9	40	60	5			2.5
	10	60	40	5			1.67

 

結(jié)果：待測蛋白質(zhì)的濃度為：         mg/mL