技術文章
醋酸纖維素薄膜電泳操作要點及常見差錯和失敗原因分析
發(fā)布時間:2013-11-30醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙?;纬傻睦w維素醋酸酯。由該物質(zhì)制成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。 種薄膜對蛋白質(zhì)樣品吸附性小,幾乎能*消除紙電泳中出現(xiàn)的“拖尾”現(xiàn)象,又因為膜的親水性比較小,它所容納的緩沖液也少,電泳時電流的大部分由樣品傳導,所以分離速度快,電泳時間短,樣品用量少,5 μg 的蛋白質(zhì)可得到滿意的分離效果。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。
醋酸纖維素薄膜與濾紙相比較,有以下優(yōu)點:
(1)分離效果好。對蛋白質(zhì)樣品吸附極少,無“拖尾”現(xiàn)象,染色后背景能*脫色,各種蛋白質(zhì)染色帶分離清晰,因而提高了定量測定的性。
(2)快速省時。由于親水性較濾紙小,電滲作用小,電泳時大部分電流是由樣品傳導的,所以分離速度快,電泳時間短,一般電泳45~60分鐘即可,加上染色、脫色,整個電泳完成僅需90分鐘左右。
(3)靈敏度高,樣品用量少,血清蛋白電泳僅需2 μl 血清,故常用于檢測在病理情況下微量異常蛋白質(zhì)的改變。
(4)應用面廣。某些蛋白質(zhì)在紙上電泳不易分離,如胎兒甲種球蛋白、溶菌酶、胰島素、組蛋白等用醋酸纖維素薄膜電泳能較好地分離。
(5)易保存,易定量。醋酸纖維素薄膜電泳染色后,經(jīng)冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板,有利于掃描定量及長期保存。
醋酸纖維素膜經(jīng)過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理后可使膜透明化有利于對電泳圖譜的光吸收掃描測定和膜的長期保存。
1. 材料與試劑醋酸纖維素膜一般使用市售商品,常用的電泳緩沖液為pH8.6的巴比妥緩沖液,濃度在0.05~0.09 mol/L。
2. 操作要點
(1)膜的預處理:必須于電泳前將膜片浸泡于緩沖液,浸透后,取出膜片并用濾紙吸去多余的緩沖液,不可吸得過干。并在一角做上記號。
(2)加樣:樣品用量依樣品濃度、本身性質(zhì)、染色方法及檢測方法等因素決定。對血清蛋白質(zhì)的常規(guī)電泳分析,每cm加樣線不超過1 μl,相當于60~80 μg的蛋白質(zhì)。
(3)電泳:可在室溫下進行。電壓為25 V/cm,電流為0.4~0.6 mA/cm寬。
(4)染色:一般蛋白質(zhì)染色常使用氨基黑和麗春紅,糖蛋白用甲苯胺藍或過碘酸-Schiff試劑,脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色。
(5)脫色與透明:對水溶性染料zui普遍應用的脫色劑是5%醋酸水溶液。為了長期保存或進行光吸收掃描測定,可浸入冰醋酸:無水乙醇=30:70(V/V)的透明液中。
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