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1. 樣品復(fù)方磷酸可待因（歐博士止咳露），批號(hào)309315 、402021，生產(chǎn)廠家為香港歐化藥業(yè)有限公司。

2. 驗(yàn)證用菌種 枯草桿菌CMCC（B）63501、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC （F） 98001、 黑曲霉CMCC（F）98003。

3. 方法 中國(guó)藥典有關(guān)微生物限度檢查法方法驗(yàn)證試驗(yàn)。                       

4. 具體操作方法

    4.1菌液制備：

（1） 取經(jīng)37℃培養(yǎng)18~24h，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌的肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水，10倍稀釋至10-5 ~10-7，細(xì)菌數(shù)約為50~100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。

（2） 經(jīng)25 ℃培養(yǎng)18~24小時(shí)的白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物1ml+9 ml鹽水10倍稀釋至10-5 ~10-7，細(xì)菌數(shù)約為50~100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。

（3） 取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3~5ml鹽水洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，然后取1 ml +9 ml鹽水，逐管10倍稀釋為10-4，細(xì)菌數(shù)約為50~100cfu/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。

4.2 供試液制備 吸取樣品10 ml ，加0.1%蛋白胨水氯化鈉稀釋液90ml濃度均為1：10供試液，分別人工污染上述5種代表試驗(yàn)菌株。

4.3 培養(yǎng)基稀釋法： 采用加0.5 ml、0.2 ml、0.1 ml /皿供試液，再加15~20 ml瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24~48小時(shí)觀察結(jié)果細(xì)菌計(jì)數(shù)，測(cè)定回收率。結(jié)果見表：

4.4 回收率測(cè)定：

（1） 試驗(yàn)組: 分別取不同品種的1：10供試液1 ml、50~100個(gè)/ ml 試驗(yàn)菌株同時(shí)加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24~72小時(shí)觀察結(jié)果。薄膜過濾法以zui后一次的沖洗液加入試驗(yàn)菌.

（2） 活菌組 測(cè)定每一菌株的試驗(yàn)菌數(shù)

（3） 供試液對(duì)照 測(cè)定供試品本底菌數(shù)

（4） 稀釋劑對(duì)照組

5 結(jié)果

菌落計(jì)數(shù)結(jié)果、常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法在復(fù)方磷酸可待因微生物限度檢查法的驗(yàn)證結(jié)果見表1、2和表3。

表1     菌落計(jì)數(shù)（cfu/ml） 

實(shí)驗(yàn)次數(shù)	金葡菌10-5	枯草桿菌10-5	白色念珠菌10-5	黑曲霉10-4	大腸埃希菌10-7
1	94、90	130、80	73、72	110、90	14、15
2	80、74	45、 23	128、108	110、120	54、34
3	153、150	78、 77	73、74	110、100	30、27

 

                                    

從表2結(jié)果可以看出: （1）采用常規(guī)方法檢驗(yàn)復(fù)方磷酸可待因溶液供試品，人工污染5株代表菌株，該供試品對(duì)大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗(yàn)均高于70%，可采用常規(guī)方法檢驗(yàn)。（2）復(fù)方磷酸可待因?qū)瘘S色葡萄球菌、枯草桿菌有不同程度的抗菌活性，供試品回收率為0.02~29.2%，均低于70%。

表2   復(fù)方磷酸可待因微生物限度檢查方法驗(yàn)證 （常規(guī)法）  

 

實(shí)驗(yàn)次數(shù)	人工染菌回收率%
	金葡菌	枯草桿菌	白色念珠菌	黑曲霉	大腸埃希菌
1	0.02	71.4	81.1	100.0	100.0
2	29.2	29.4	100.0	100.0	100.0
3	抑菌	抑菌	100.0	100.0	100.0

    

  表3  培養(yǎng)基稀釋法（1ml加2個(gè)平皿）復(fù)方磷酸可待因微生物限度檢查驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)次數(shù)	人工染菌回收率%
	金葡菌	枯草桿菌
1	80.7	100.0
2	91.4	100.0

 

      

              

    表3中的結(jié)果證明，采用培養(yǎng)基稀釋法可消除供試品對(duì)人工污染金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抑菌作用。回收率達(dá)到70%以上。因此，培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿）可用于復(fù)方磷酸可待因（歐博士止咳露）的微生物限度檢查。

6 結(jié)論

根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，確定復(fù)方磷可待因（歐博士止咳露）溶液微生物限度檢查法為細(xì)菌數(shù)測(cè)定可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿）測(cè)定，霉菌數(shù)可采用常規(guī)法測(cè)定。

注：常規(guī)法為1ml供試液加15~20ml菌落計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基；培養(yǎng)基稀釋法則為0.5ml供試液加15~20ml菌落計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基為2倍稀釋，0.2ml供試液加15~20ml菌落計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基為5倍稀釋。