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【操作步驟】
（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗滌細(xì)胞2次，以去除消化液及原生長(zhǎng)培養(yǎng)液；
（2）用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)L929細(xì)胞濃度為2×105/ml；
（3）將上述細(xì)胞懸液加至96孔培養(yǎng)板，100 ul/孔；
（4）置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；
（5）吸去細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，各孔分別加入倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，100ul/孔，各設(shè)雙復(fù)孔，并設(shè)培養(yǎng)液陰性對(duì)照及空白對(duì)照（即L929細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品均不加入，僅加培養(yǎng)液）；
（6）同時(shí)向各孔均加入10ul放線菌素D（0.5～1μg/孔）；
（7）置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14h；
（1） 直接于每孔中加入MTT溶液，10μl/孔 ，37℃孵育4h；
（2） 從每孔中輕輕吸出培養(yǎng)上清液100μl/孔 ，棄去 ，再于每孔中加入酸化異丙醇或DMSO，100μl/孔，混勻，置室溫10min；
（3） 用酶標(biāo)儀以檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm分別測(cè)各孔OD值。
【結(jié)果分析】
（1） 取雙復(fù)孔平均值，各孔OD值為OD570nm-OD630nm，再減去空白對(duì)照OD值。
（2） 根據(jù)各孔OD值，分別計(jì)算出各稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的L929細(xì)胞死亡率?？砂聪率接?jì)算：
各孔細(xì)胞死亡率 = 陰性對(duì)照孔OD-含TNF孔OD × 100%
陰性對(duì)照孔OD

（3）以Log2[稀釋度]為橫座標(biāo)（X），以細(xì)胞死亡率（%）為縱座標(biāo)（Y），分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品曲線，根據(jù)導(dǎo)致50%細(xì)胞死亡的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品曲線，根據(jù)導(dǎo)致50%細(xì)胞死亡的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品稀釋度，按下式計(jì)算樣本TNF的活性單位：
TNF的活性單位
（U/ml） = 標(biāo)準(zhǔn)品導(dǎo)致50%細(xì)胞死亡的待測(cè)樣品稀釋度 × 標(biāo)準(zhǔn)品活性單位
（U/ml）
導(dǎo)致50%細(xì)胞死亡的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度

（4）亦可根據(jù)正態(tài)概率紙法和概率單位法求得待測(cè)樣品TNF活性單位，可參見(jiàn)IL-1、IL-2的生物活性檢測(cè)部分及醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)的有關(guān)內(nèi)容。
【注意事項(xiàng)】
（1） L929細(xì)胞要充分洗滌，以去除原培養(yǎng)液，同時(shí)應(yīng)均勻分布于各孔中，以免影響檢測(cè)結(jié)果。
（2） L929細(xì)胞不宜生長(zhǎng)過(guò)密，只要孔內(nèi)長(zhǎng)成單層即可使用。
（3） L929細(xì)胞存活率應(yīng)＞95%。
（4） L929細(xì)胞隨著傳代或受其他因素影響，對(duì)放線菌素D的敏感性會(huì)有差異，應(yīng)先作預(yù)試驗(yàn)確定其使用濃度。
（5） 倍比稀釋TNF標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品時(shí)，應(yīng)以1:2開(kāi)始至少6個(gè)稀釋度。
（6） MTT染色，其著色深淺不但與細(xì)胞數(shù)有關(guān)，還與細(xì)胞激活有關(guān)。如某種因素激活細(xì)胞后，其代謝率將增強(qiáng)，線粒體琥珀酸脫氫酶活性亦增強(qiáng)，著色也將加深。因此MTT染色時(shí)，應(yīng)考慮待測(cè)樣品中是否含有能激活靶細(xì)胞的因素存在。
（7） 加入酸化異丙醇后，應(yīng)在1h內(nèi)測(cè)定各孔OD值。
（8） 本法亦可適用于待測(cè)細(xì)胞mTNF的檢測(cè)。