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（一）蛋白質(zhì)的分離
利用5％～20％梯度的SDS-PAGE、尿素—PAGE、等電點(diǎn)聚焦（1EF）—PAGE、雙向凝膠或瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，其基本操作與凝膠電泳一樣。不同之處是，凝膠厚度需0．8mm，經(jīng)分離后的凝膠（SDS-PAGE除外）要浸泡在含SDS的緩沖液中，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷，以利于凝膠中的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中轉(zhuǎn)移到正極邊的NC膜上。因此，在分離蛋白質(zhì)時(shí)，大多數(shù)是用SDS-PAGE系統(tǒng)進(jìn)行的。不過(guò)，也有用非SDS-PAGE系統(tǒng)替代的，如用此系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)移操作時(shí)，則需將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到處于正極和負(fù)的兩張NC膜上（即將凝膠置兩張NC膜之間），該程序的靈敏度較低。

（二）NC膜的處理
取一張與凝膠條大小相等的NC紙（用手術(shù)刀切），浸泡在電泳轉(zhuǎn)移的緩沖液（一般為25mmol／L Tris，191mmol／L甘氨酸，20％甲醇）中0．5h（國(guó)產(chǎn)NC紙浸泡2h以上）。

（三）凝膠的處理
樣品在SDS-PAGE中電泳后，切下欲轉(zhuǎn)移的凝膠條區(qū)段或?qū)⒄麄€(gè)凝膠板浸泡在電泳轉(zhuǎn)移緩沖液中0．5h，輕輕搖動(dòng)除去膠中的SDS、巰基乙醇等物質(zhì)，使凝膠中的離子強(qiáng)度與轉(zhuǎn)移液相同，以利于蛋白質(zhì)恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性，防止凝膠的膨脹。

（四）準(zhǔn)備海綿和濾紙
剪裁與NC膜大小相同的海綿和濾紙各兩塊，用電極緩沖液浸濕。

（五）“夾心餅”的制作
先把有孔洞的有機(jī)玻璃板放在干凈的玻璃板上，然后蓋上一塊海綿，海綿上鋪一層濾紙，接著小心地把凝膠平放在濾紙上，NC膜要端端正正地放在膠面上（一旦放下就勿拿起）。在NC膜上依次蓋上濾紙、海綿和有孔洞的有機(jī)玻璃板。zui后用橡皮筋捆緊，放入裝有電極緩沖液的電場(chǎng)中。夾有凝膠的一端朝負(fù)極，夾有NC膜的一端朝正極。通電后調(diào)節(jié)電流為60mA左右（恒流），4℃環(huán)境下電泳6—18h。在制作“夾心餅”時(shí)，每?jī)蓪又g不能有氣泡，否則影響樣品的轉(zhuǎn)移。此外，電極液中應(yīng)含有20％的甲醇，以防電泳過(guò)程中凝膠變形。分子質(zhì)量大轉(zhuǎn)移時(shí)間長(zhǎng)，反之則時(shí)間短。通常轉(zhuǎn)移過(guò)程也是進(jìn)一步除去SDS和恢復(fù)轉(zhuǎn)移物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物活性的過(guò)程。

（六）鑒定
1．酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA） （1）試劑：①PBS液，含0．15mol／LNaCl的0．025mol／L磷酸鹽緩沖液，pH7．4；②PBS-T液，含0．3％吐溫的PBS液（淬滅劑）；③HBP-IgG溶液，HRP-人抗體復(fù)合物溶液；④聯(lián)苯茴香胺溶液，50mg聯(lián)苯茴香胺溶于10ml甲醇中；⑤染色液（用前配制），取27ml bPBS-T液，3ml聯(lián)苯茴香胺液，35ul3％*溶液混勻。
（2）染色：印跡后的NC膜在50～200mlPBS液中漂洗5min，除去粘在NC膜上的凝膠，而后在PBS-T或PBS-BSA（含3％的牛血清清蛋白的PBS）溶液中，37℃環(huán)境下，手搖振蕩15min（封阻反應(yīng)），與酶標(biāo)記物溶液20ml（1；25，稀釋度視HRP活力高低而定）反應(yīng)2h（37℃環(huán)境下），再用PBS、PBS-T或PBS-BSA分別漂洗。接著轉(zhuǎn)入30ml（如膜為4cmX8cm時(shí)）染色液浸泡5min左右，即可顯出特異的抗原棕色譜帶（注意：一旦譜帶顯示立即取出），用蒸餾水漂洗后，密封保存于4℃的蒸餾水中。
2．放射自顯影術(shù) 封阻后的NC紙與放射性核素標(biāo)記的抗體或其他相應(yīng)的配體進(jìn)行反應(yīng)，接著經(jīng)過(guò)漂洗、烘干、壓片和沖洗，即可呈現(xiàn)自顯影譜帶。
除上述鑒定方法以外，使用印度墨水、天津繪圖墨水、氨基黑和考馬斯亮藍(lán)等試劑也可進(jìn)行染色，以鑒定印跡在NC膜上的蛋白質(zhì)譜帶。