山東中醫(yī)藥大學(xué)楊傳華團(tuán)隊發(fā)表了一項研究，題為“基于UPLC-MS探討痰濕壅盛型高血壓病小鼠血漿代謝組學(xué)特點"。研究通過檢測痰濕壅盛型高血壓病模型小鼠的血漿代謝組學(xué)變化，挖掘該證候的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，從整體角度闡釋痰濕壅盛型高血壓病模型小鼠的代謝特征。

摘要

目的：通過檢測痰濕壅盛型高血壓病模型小鼠的血漿代謝組學(xué)變化，分析挖掘該證候的潛在生物學(xué)

標(biāo)志物，從整體角度闡釋痰濕壅盛型高血壓病模型小鼠的代謝特征。方法：高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6Cnc小鼠25周， 觀察小鼠一般情況和主動脈組織形態(tài)，UPLC-MS分析血漿代謝組變化，結(jié)合多維統(tǒng)計和單位統(tǒng)計分析篩選組間差 異代謝物，并進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析。結(jié)果：模型組小鼠出現(xiàn)痰濕壅盛證特征表現(xiàn)，體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、 收縮壓、舒張壓、血糖/胰島素、瘦素水平較對照組顯著升高（P<0.05），空腹胰島素顯著降低（P<0.05），主 動脈出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變和脂質(zhì)沉積。UPLC-MS共篩選出差異代謝物125個（其中64個升高，61個降低；VIP>1且 P<0.05），差異最大的代謝物依次為磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、L-異亮氨酸、乙酰肉堿等。差異代謝物主要富集于膽堿代謝、GnRH信號通路、氨基酸的合成、FcγR介導(dǎo)的吞噬作用、磷脂酶D信號途徑等（P<0.01），以及產(chǎn)熱、EGFR信號通路、NF-κB信號通路等（P<0.05）。結(jié)論：磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、L-異亮氨酸、乙酰肉堿可作為痰濕壅盛型高血壓病小鼠模型的特征血漿代謝標(biāo)志物。

實驗材料與儀器

實驗動物：8周齡SPF級雄性C57BL/6Cnc小鼠27只，體質(zhì)量（22±2）g

高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料83.75%，15%脂肪，1.25%膽固醇。

試劑：水合氯醛、甲醇、甲酸、水、乙腈、L-2-氯苯丙氨酸、LysoPC17:0、其他所有試劑均為分析純或色譜級。

儀器：IITC MRBP鼠尾血壓監(jiān)測儀、QE高分辨質(zhì)譜儀、Nexera UPLC高效液相色譜儀、Acquity UPLC BEH C18色譜柱、TYXH-I漩渦振蕩器、TGL-16MS臺式高速冷凍離心機(jī)。

IITC MRBP鼠尾血壓監(jiān)測儀

實驗過程

小鼠一般情況觀察與模型判定：每日觀察小鼠一般情況；每周記錄小鼠體質(zhì)量、身長（鼻尖至尾根），計算Lee‘s指數(shù)≡體質(zhì)量（g）1/7×10/體長（cm）；每周清醒狀態(tài)下尾動脈加壓法檢測小鼠血壓，設(shè)定保溫桶溫度32℃，平衡穩(wěn)定5~10min，間隔40s，連續(xù)測量3次，取平均值。25周后，以體質(zhì)量、血壓均≥對照組平均值25%者作為判定“痰濕壅盛型高血壓病小鼠模型"成功的標(biāo)準(zhǔn)，篩選9只納入模型組，為避免極值，再進(jìn)一步淘汰此9只小鼠中體質(zhì)量大和小的各1只，共納入7只模型小鼠進(jìn)行后續(xù)實驗，其余淘汰過量麻醉處死。

樣本采集及主動脈組織形態(tài)觀察：25周后，10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，下腔靜脈取血，EDTA抗凝，室溫下3500r/min離心（離心半徑：7.8cm）15min，取上清液。化學(xué)法檢測小鼠空腹血糖、空腹胰島素、瘦素含量，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科進(jìn)行檢測。冰上分離小鼠主動脈，分為2份：一部分以10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片厚度4μm，蘇木素-伊紅（HE）染色觀察組織學(xué)改變；另一部分以2.5%戊二醛固定，透射電鏡觀察主動脈亞細(xì)胞水平形態(tài)變化，電鏡樣品制備和觀察委托山東微亞生物科技有限公司進(jìn)行。

血漿樣品前處理：100μL血漿加入內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸，0.3mg/mL；LysoPC17:0，0.01mg/mL，均為甲醇配置）10μL渦旋震蕩10s，加入300μL甲醇-乙腈（V:V=2:1），渦旋震蕩1min，超聲提取10min，-20℃靜置30min；室溫下13000r/min離心（離心半徑：7.8cm）10min，取300μL上清液揮干，400μL甲醇-水（V:V=1:4）復(fù)溶，渦旋30s，超聲2min，室溫下13000r/min離心（離心半徑：7.8cm）10min，取上清液，以0.22μm有機(jī)相針孔過濾器過濾。質(zhì)控樣本（QC）由所有樣本的提取液等體積混合而成。

液相色譜-質(zhì)譜分析：采用Nexera UPLC超高效液相串聯(lián)QE高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；柱溫：45℃；流動相：A-水（含0.1%甲酸），B-甲醇；流速：0.35mL/min；進(jìn)樣體積：10μL。梯度洗脫：0min時A 95%、B 5%；1.5min時A 95%、B 5%；5.0min時A 70%、B 30%；7.0min時A 30%、B 70%；10.0min時A 1%、B 99%；12.0min時A 1%、B 99%；15.0min時A 95%、B 5%。質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正負(fù)離子掃描模式。質(zhì)譜參數(shù)：質(zhì)量掃描范圍：60~900；分辨率（full scan）：70000；分辨率（HCD MS/MS scans）：17500；噴霧電壓：3.5kV（正離子），3.1kV（負(fù)離子）；鞘氣流速：30Arb；輔助氣流速：10Arb；毛細(xì)管溫度：320℃。

數(shù)據(jù)處理：UNIFI 1.8.1軟件用于原始數(shù)據(jù)的采集。原始數(shù)據(jù)經(jīng)Progenesis QI v2.3軟件（Nonlinear Dynamics）進(jìn)行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化?；衔锏蔫b定基于精確質(zhì)量數(shù)、二級碎片以及同位素分布，使用The Human Metabolome Database（HMDB）和Lipidmaps（v2.3）以及METLIN數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性。根據(jù)化合物定性結(jié)果打分（Score）進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為≥30分（滿分60分），將正負(fù)離子數(shù)據(jù)合并成一個數(shù)據(jù)矩陣。采用無監(jiān)督的主成分分析（PCA）來觀察各樣本之間的總體分布，有監(jiān)督的偏最小二乘法分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）來區(qū)分各組間的總體差異。采用七次循環(huán)交互驗證和200次響應(yīng)排序檢驗（RPT）考察模型的質(zhì)量，綜合對比結(jié)果，多維分析和單維分析相結(jié)合，篩選組間差異代謝物。并基于KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析，以挖掘兩組樣本中代謝途徑變化機(jī)制。

實驗結(jié)論

經(jīng)高脂飼料長期喂養(yǎng)的小鼠，最終建立了痰濕壅盛型高血壓病小鼠模型。UPLC-MS篩選出125個血漿差異代謝物，差異最大的代謝物（VIP排序）依次為磷脂酰膽堿、三氯乙醇葡萄糖醛酸、溶血磷脂酰膽堿、L-異亮氨酸、乙酰肉堿等。模型組小鼠血漿中多種磷脂酰膽堿水平升高，磷脂酰膽堿（16:0/0:0）升高了1.853倍，磷脂酰膽堿[0-16:1(11Z)/2:0]升高了2.513倍，磷脂酰膽堿[16:0/9:0(COOH)]升高了2.133倍，磷脂酰膽堿[22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0:0]升高了1.904倍。模型組小鼠多種溶血磷脂酰膽堿升高，溶血磷脂酰膽堿[18:2(9Z,12Z)]升高了2.166倍，溶血磷脂酰膽堿[18:1(9Z)]升高了2.260倍，溶血磷脂酰膽堿[20:3(5Z,8Z,11Z)]升高了3.324倍，溶血磷脂酰膽堿[18:3(9Z,12Z,15Z)]升高了2.917倍。L-異亮氨酸下調(diào)了5.128倍（1/0.195）。乙酰肉堿升高了1.960倍。痰濕壅盛型高血壓病小鼠模型組與對照組比較，差異代謝物多集中于脂類小分子，磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、L-異亮氨酸、乙酰肉堿可作為痰濕壅盛型高血壓病模型小鼠的特征代謝標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)

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2. Nie C, He T, Zhang W, et al. Branched chain amino acids: Beyond nutrition metabolism. Int J Mol Sci, 2018, 19(4):954.