2025年1月23日，神戶學(xué)院大學(xué)的Ken-ichi Mizutani研究團隊在期刊《Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry》上發(fā)表了一篇題為“Rosae multiflorae fructus extracts regulate the differentiation and vascular endothelial cell-mediated proliferation of keratinocytes"的論文。研究聚焦野薔薇果提取物對角質(zhì)形成細胞的調(diào)控作用，深入探究其對表皮分化、屏障功能、血管內(nèi)皮細胞介導(dǎo)的增殖及傷口愈合的影響，同時鑒定了發(fā)揮作用的關(guān)鍵活性成分及相關(guān)分子機制。

摘要

角質(zhì)形成細胞是表皮的主要組成成分，維持其增殖與分化的精確平衡對于保護表皮結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。野薔薇果提取物在化妝品行業(yè)應(yīng)用廣泛，但其一角質(zhì)形成細胞有益作用的分子機制尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，RMFE可促進體外培養(yǎng)的人正常表皮角質(zhì)形成細胞和三維表皮模型的表皮分化，增強其屏障功能。此外，RMFE能促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖和血管生成，而經(jīng)RMFE處理的HUVEC條件培養(yǎng)基可進一步促進NHEK增殖并提升其傷口愈合能力。成分活性分析表明，槲皮素衍生物可能是介導(dǎo)NHEK和HUVEC對RMFE產(chǎn)生應(yīng)答的關(guān)鍵物質(zhì)。綜上，這些結(jié)果提示RMFE通過直接作用于角質(zhì)形成細胞和內(nèi)皮細胞介導(dǎo)的間接作用，共同增強表皮功能。

實驗材料與儀器

材料

1. 野薔薇果提取物、化學(xué)化合物（異槲皮苷IQ、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷Q3GA、槲皮素3-O-β-D-半乳糖苷Q3Gal、鞣花酸EA、鞣花酸4-O-β-D-木糖苷EADX、鞣花酸4-O-α-L-阿拉伯呋喃糖苷EALA、仙鶴草素AM等）、鈣離子檢測試劑盒、細胞增殖檢測試劑盒、細胞毒性檢測試劑、凋亡與死細胞檢測試劑盒、BrdU、Mitomycin C。

2. 細胞系：人正常表皮角質(zhì)形成細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞、人正常真皮成纖維細胞

3. 培養(yǎng)基及添加物：KGM-Gold培養(yǎng)基及添加因子試劑盒、EGM-2培養(yǎng)基及添加因子試劑盒、FGM-2培養(yǎng)基及添加因子試劑盒。

4. 細胞模型：三維皮膚表皮培養(yǎng)模型

5. 抗體：抗TJP1一抗、抗LOR一抗、抗OCLN一抗、抗CLDN1一抗、Alexa Fluor 488標記驢抗兔IgG二抗、Alexa Fluor 594標記驢抗小鼠IgG二抗、抗BrdU單克隆抗體。

6. 其他：Matrigel、硅膠柱、DAPI染色液。

儀器

CO?培養(yǎng)箱、離心機、濾膜、酶標儀、細胞分析儀、實時熒光定量PCR儀、共聚焦顯微鏡、跨上皮電阻儀、ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀、相差顯微鏡、全功能熒光顯微鏡、液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀、熱板、ImageJ圖像分析軟件、Adobe Photoshop圖像處理軟件、Microsoft Excel。

ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀

實驗過程

1. 試劑制備與細胞培養(yǎng)：RMFE凍干粉溶解于實驗緩沖液或培養(yǎng)基中，使用多個批號提取物驗證效果一致性；NHEK、HUVEC、NHDF分別在對應(yīng)培養(yǎng)基中于37℃、5%CO?條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基每2天更換一次，NHEK采用3名供體混合樣本以避免個體差異。

2. 條件培養(yǎng)基制備：P4代HUVEC或NHDF培養(yǎng)至50%-60%匯合度，經(jīng)RMFE處理24小時后更換為KGM-Gold培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集培養(yǎng)基，離心去除細胞碎片并過濾，制備內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)基或成纖維細胞條件培養(yǎng)基，以無細胞培養(yǎng)的KGM-Gold培養(yǎng)基為對照。

3. 三維皮膚表皮模型培養(yǎng)：將RMFE應(yīng)用于LabCyte EPI-MODEL24 6D模型的角質(zhì)層側(cè)，在37℃、5%CO?條件下培養(yǎng)2或7天，每日更換含或不含RMFE的培養(yǎng)基。

4. 細胞增殖檢測：細胞接種于96孔板培養(yǎng)24小時后，經(jīng)RMFE或目標化合物處理24小時，采用Cell Counting Kit-8檢測，測定450 nm處吸光度值并計算平均吸光度。

5. 細胞毒性與死細胞檢測：NHEK接種后經(jīng)不同濃度RMFE處理，采用WST-1試劑檢測細胞毒性，通過Muse Annexin V & Dead Cell Kit結(jié)合Guava Muse Cell Analyzer檢測凋亡及死細胞比例。

6. RT-qPCR檢測：提取細胞總RNA并合成cDNA，采用SYBR Green標記進行定量PCR，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參基因，分析分化標志物、屏障功能相關(guān)基因、表皮干細胞標志物及血管生成相關(guān)基因的表達水平。

7. 免疫熒光染色與成像：細胞或三維模型經(jīng)4%多聚甲醛固定、封閉液處理后，加入一抗孵育過夜，再與熒光二抗孵育，DAPI染色細胞核，通過共聚焦顯微鏡獲取圖像；采用BrdU摻入法結(jié)合免疫熒光染色評估細胞增殖。

8. 屏障功能檢測：三維模型經(jīng)RMFE處理2天后，使用跨上皮電阻儀檢測TEER值，計算單位面積電阻；通過ASCH VAPOSCAN 經(jīng)皮水分流失測量儀檢測TEWL值，模型先在37℃熱板上放置30分鐘后再進行測量。

對照組和0.25 μ RMFE 處理的三維培養(yǎng)人表皮模型的跨表皮水分流失(TEWL)值      

9. 管形成實驗：48孔板包被Matrigel并孵育，接種P4代HUVEC并加入含RMFE的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6小時后通過相差顯微鏡獲取圖像，ImageJ軟件分析管長、分支點數(shù)量及連接點數(shù)量。

10. 劃痕實驗：NHEK接種形成單層細胞后，用微量移液器吸頭劃痕，更換為含RMFE、對照ECCM或RMFE-ECCM的培養(yǎng)基，部分組添加Mitomycin C抑制增殖，培養(yǎng)48小時并進行時間序列成像，計算傷口閉合率。

11. LC-TOF/MS分析：采用液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀分析RMFE成分，鑒定其含有的化學(xué)化合物。

12. 統(tǒng)計分析：兩組數(shù)據(jù)采用非配對雙側(cè)Student's t檢驗分析差異，結(jié)果以平均值±標準誤（SEM）表示，P<0.05、P<0.01、P<0.001分別表示不同水平。

實驗結(jié)論

1. RMFE可直接促進NHEK和三維表皮模型的表皮分化，上調(diào)早期分化標志物（K10、SPRR1B）和晚期分化標志物（兜甲蛋白、LOR）的表達，且K10表達呈劑量依賴性增加；同時上調(diào)緊密連接相關(guān)基因（OCLN、CLDN1、TJP1）及蛋白表達，增強TEER值并降低TEWL值，提升表皮屏障功能，該作用并非由鈣離子介導(dǎo)。

2. RMFE能促進HUVEC增殖和血管生成，RMFE-ECCM可促進NHEK增殖、上調(diào)表皮干細胞標志物（K15、DLL1）表達，且提升NHEK傷口愈合能力，該愈合作用依賴細胞增殖而非遷移；而RMFE-DFCM對NHEK無明顯影響，表明RMFE的作用更依賴內(nèi)皮細胞介導(dǎo)。

3. LC-TOF/MS鑒定顯示，本研究使用的RMFE為II型（不含多花苷A），包含槲皮素衍生物（IQ、Q3GA、Q3Gal）、鞣花酸及其衍生物（EADX、EALA、AM、EA）等成分。

4. 槲皮素衍生物（尤其是IQ）是RMFE發(fā)揮作用的關(guān)鍵活性成分，可直接促進NHEK分化和屏障功能形成，降低TEWL值，同時促進HUVEC增殖并上調(diào)血管生成相關(guān)基因（內(nèi)皮粘蛋白、DLL4、Apelin）表達。

5. 綜上，RMFE通過直接作用于角質(zhì)形成細胞和內(nèi)皮細胞介導(dǎo)的間接作用，雙重調(diào)控表皮增殖與分化平衡，增強表皮屏障功能并促進傷口愈合，為其在化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了分子機制支持。